又一篇流式答疑解惑

niwanmao

2014年，我们在流式中文网论坛上发过一篇流式细胞术实验中常见问题和解决方法（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3585-1-1.html），最近，国外一个叫StressMarq的公司也总结了一篇，其总结的点还是挺有实际意义的，故编译分享，部分内容我们略作修正和增补。

信号弱或无信号
补偿不正确
解决方法：确保在流式实验中使用单染管，进行正确的补偿调节，如果补偿过度，可能导致信号弱或无。

如果检测的是胞内信号，可能是细胞未破膜
解决方法：
- 可以用甲醇或丙酮破膜（流式中文网注：此类破膜剂过于剧烈，可能会对表面标记和细胞形态影响大，谨慎使用）
- 甲醛固定，接着用Triton X-100破膜

目标蛋白表达弱
解决方法
- 确保前期实验中进行了正确的处理使得目的蛋白得到表达
- 采用正确的对照（生物学阴性对照或未处理对照、阳性对照等等）
- 如果蛋白确实有，但丰度低，可考虑采用间标等方式使其信号得以扩增
- 对于细胞器内的蛋白（例如线粒体膜），也可考虑分离出细胞器，浓缩后再进行标记。

细胞固定过度
解决方法
- 减少固定的时间、固定剂的浓度。推荐1％多聚甲醛15分钟以内。

目标蛋白含量不低，但信号仍弱
解决方法
- 给抗原分配亮度高的荧光素
- 避免过度暴露于光照导致光淬灭。抗体保存务必避光。

二抗不匹配
解决方法
- 二抗应该是针对一抗的宿主种属的，例如一抗是小鼠源性（例如Mouse Anti-HSP70），那么二抗应该采用抗小鼠的（例如Goat Anti-Mouse）

激光器或滤光片设置错误
解决方法
- 确保流式细胞仪配置了正确的激光器和滤光片。例如DAPI紫外激发的，那么需要注意你的机器是否配置了紫外激光器以及相应的滤光片。

一抗用量不足
解决方法：
- 采用更高浓度的一抗

抗体储存问题
解决方法
- 冻融步骤会使抗体降解，所以非荧光素标记的抗体即使冻存，尽量小管分装，尽量避免反复冻融。荧光素标记的抗体尽量4度保存。
- 抗体保存不当(例如温度、避光等均未做好)

靶细胞上是否表达目的蛋白不清楚
解决方法
- 用阳性对照确认检测没有问题，然后再去检测靶细胞，如果仍偏弱，需采用间标或更强荧光素抗体等方法纠正。

孵育时间过短解决方法
- 增加孵育时间，大多为15分钟，亦可增加至30分钟。

信号强度高
抗体浓度过高
解决方法
- 减少一抗或二抗用量

洗涤不充分
解决方法
- 各步骤之间的洗涤很关键，抗体孵育之后尽量正确洗涤。

未正确阻断
解决方法
- 采用正确的Fc Blocking或BSA阻断。

电压过高
- 采用正确的阴性和阳性对照，使电压处于合适范围。

出现了两个细胞群
可能是样本保存不当或时间过长
解决方法
- 细胞发生凋亡，容易使FSC减小，出现两群细胞。可考虑采用流式中文网的FlowGuard®保存液(有试用意向可联系流式中文网团队张鸿， 13868761667，zhanghong@flowcyto.cn)

细胞粘连
解决方法
- 过滤、充分打散

SSC大
细胞死亡
解决方法
- 尽量用新鲜标本，如果实在需要保存，可考虑采用流式中文网的FlowGuard®保存液(有试用意向可联系流式中文网团队张鸿， 13868761667，zhanghong@flowcyto.cn)

细菌污染
解决方法
- 尽量使用新鲜标本，避免细菌污染。

获取时事件少
细胞团块堵进样针
解决方法
- 上机前，尽量用枪头轻轻吹打混匀细胞，并注意去除吹打不散的团块。

细胞少
解决方法
- 样本的细胞浓度尽量在1×10E6个/ml左右，并且上机前混匀。

获取时事件多
细胞量多
解决方法
- 将细胞密度稀释至1×10E5到1×10E6/ml.

细菌等杂质污染
解决方法
- 尽量用新鲜样本，并再试一次。


信源：
https://www.stressmarq.com