AML MRD检测的MD Anderson癌症中心经验

niwanmao

MD Anderson癌症中心开展AML MRD多色流式检测的时间不算早，大约2012年开始到现在共进行了12000多次AML MRD检测，并与分子生物学进行了较好的关联性分析。MD Anderson癌症中心Xu Jie等人在Clin. Lab. Med. 12月份这期的文章《How Do We Use Multicolor Flow Cytometry to Detect Minimal Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia?》给了我们很好的总结。
1、方案
8色方案，4管（不得不感叹国外的抗体像不要钱似的用）


2、设门
（1）每管分析均先排除碎片和粘连体，以前介绍过不少，故不再展示。4管8色方案，每一管均有CD45、CD34、CD19，故后续的设门主要针对这三个抗体。
（2）接着如下A图所示选择CD45dim的原始细胞区域和单核细胞区域：


（3）接着如B图选择CD34＋细胞，并反过去看一下这些细胞在CD45/SSC散点图上的位置，这里不用CD117设门，是因为在正常骨髓中，CD117＋细胞包含了髓系前体、部分早幼粒、早期红系细胞、肥大细胞和小部分未成熟NK细胞：


（4）再接着，按C图所示排除CD19＋的B系前体细胞和浆细胞。对于那些表达CD19的AML，需注意将这个门移到空白区域：
上面这几个门的依据是：a、CD34 +原始髓系细胞是AML治疗后耐药性较强的细胞，是检测异常细胞最可靠的细胞群;b、如果不将CD34 +细胞单独分出来，MRD的检测敏感性明显下降 ；c、有助于通过中位荧光强度（MFI）定量CD34 +原始髓系细胞上的重要标志物的表达水平；d、CD45dim门的检查对于评估CD34阴性或部分阳性的AML很重要，（参见稍后有关单核细胞分化的AML的讨论）， CD45dim门内任何异常事件都应该进一步分析。

（5）最后，对第4步得到的CD34＋细胞分析抗原表达，包括抗原表达强度、分化轨迹等等：


3、报告
诱导和巩固治疗刚结束时，细胞可能很少，此时尽量取到20万个以上细胞。细胞量足够的话，尽量获取50万以上。
(1)阳性标准，以下三种情况都可判断为阳性：阳性细胞数≥20个且成群，并且其有2个或2个以上标记异常；阳性细胞数≥20个且成群，并且便有1个明显与正常不同的异常标记；阳性细胞数<20个，但有多个且高度异常的特征。异常原始髓系细胞的比例按照占总细胞数计算（排除未裂解的红细胞之后）。
(2)阴性标准：在获取细胞量足够的样本中，未检测到AML MRD，可报阴性。但报告中必须指出本次分析的敏感度，例如：如果细胞总数5万～20万，应指出「有限的样本中未检测到AML MRD」，如果细胞总数<5万，应指出「在极度有限的样本中，AML MRD评估能力不足」。
(3)MRD不确定：偶尔有样本中出现髓系前体细胞，表型改变轻微或处于临界状态，不符合阳性标准，通常应报告为“具有不确定意义的非典型表型，AML MRD不确定”，并加上备注，提示一下鉴别诊断包括：不典型的骨髓恢复表型、潜在的增生异常或前白血病克隆、表型漂移的残留AML细胞等。尽管此类情形的MRD临床意义不确定，但对于此类情况，需加强病人的随访。根据MD Anderson的经验，在有些病人这种表型一直存在，往往提示持续存在的增生异常克隆或前白血病克隆。


分析策略1：针对CD34＋细胞
AML MRD检测依赖于检测到CD34＋细胞上不正常或与反应性、再生性改变不一致的变化。因此，在分析MRD前，首先需要对一些正常骨髓进行分析，以确定正常分化的表达模式和表达水平。在接受过化疗或生长因子治疗的患者的骨髓中、在HSCT后或者存在并发症的患者中，可以看到一些非典型的改变。与未受干扰的骨髓相比，这些可能与正常情况不同。因此，正常的骨髓测试应该包括「来自不具有造血系统肿瘤但具有各种医学状况或正在从治疗中恢复的患者的骨髓样品」。通过分子诊断试验为阴性的标本（特别是那些原本存在复发性易位的），作为正常对照是特别有用的。
分析的指标包括：CD13/CD33的表达模式，CD13、CD34、CD38、CD117、CD123、HLA-DR的MFI范围，跨系抗原（CD2、CD5、CD7、CD19、CD22、CD56）表达，成熟抗原不同步表达（CD4、CD64、CD15）。正常骨髓的典型图形见前面的设门一节。
常见异常包括：CD13、CD34、CD117、CD123表达增高，CD38、HLA-DR表达降低，跨系抗原表达，成熟抗原不同步表达。
不过需要注意的是，在新生骨髓中，有部分细胞也可以出现CD38降低（见下图），不过这类CD34＋细胞还是比较有特征的，常表现为CD13、CD33、CD117、CD123、HLA-DR比其它CD34＋细胞偏弱，并且伴CD4弱表达。
新生骨髓的常见表型如下图（绿色箭头是pDC前体，黑色箭头是新生骨髓CD34＋细胞的表达特点：CD7部分表达、CD2部分表达、CD38高）：
尽管91％AML患者均会出现LAIP表型漂移，但在初次化疗结束后的骨髓中，残留白血病细胞基本上和初发表型还是一致的。大约24％的AML患者在治疗后会出现MRD表型与初发完全不同，可能性有以下 几种：(1)初发时本身就存在一个与主克隆表型完全不同的微小白血病克隆，化疗中耐药，化疗之后快速增殖。(2)尤其是老年人中，AML是非常复杂的疾病，其白血病发生过程可能需要经历很多基因突变，所以存在众多亚克隆。(3)AML细胞可能发生克隆演变、克隆进展或两者同时进行。 后者在高剂量诱导化疗后第一次的骨髓中很少发生。 然而，随着近年来对老年AML治疗的修改，如低甲基化剂结合小分子抑制剂联合应用或单独应用，诱导治疗过程可能比标准诱导化疗更长，于是克隆演变或进展可能更频繁地发生。(4)治疗可能改变了某些标记的表达水平。
这里值得一提的是，对于伴单核分化的AML（如AML-M4、AML-M5a、AML-M5b、CMML进展过来的AML等），其MRD分析特别难。虽然CD14的完全缺失可提示成熟度不够，但只发生很少病例中；至于其它的标记，如CD13、CD36、HLA-DR的降低，CD15的增高，虽然在肿瘤性单核细胞中可见到，但并非特异性，在反应性单核细胞以及增生不良的单核细胞中也可发生；还有，治疗后，肿瘤性单核细胞可出现表型的进一步成熟和分化，而化疗后或HSCT后反应性单核细胞又可出现CD56增高和HLA-DR、CD45表达降低；更有甚者，很多情况下微量肿瘤性单核细胞混杂在大量的反应性单核细胞中。以上各种情形，使得肿瘤性单核细胞难以区分。所以MD Anderson的建议是对于单核分化的AML，还是着重于CD34＋原始髓系细胞的分析更靠谱。


分析策略2：CD45dim门内CD34－非单核原始细胞
对于CD45dim原始细胞门内，除了CD34＋细胞外，CD34－部分也不能漏过。以下面这个病例为例，初诊(A)时，CD33＋、CD13dim、CD117＋、CD123＋、HLA-DR－、CD34－，核型正常，DNMT3A、IDH2、NPM1突变阳性。B图是治疗后，结果出现CD34＋原始细胞复发，CD13、HLA-DR亦均出现表达明显增高。但只有这些白血病细胞吗？不，再看C图，圈CD34－细胞，检查CD33、CD13、CD123、CD34、CD117、HLA-DR的表达，与初发几乎一模一样(仅CD123增高)，所以可以认为CD34－白血病细胞仍在。



OK，上面是就流式中文网为大家带了的MD Anderson这篇关于AML MRD检测的综述，当你看完并领悟、实践之后，你就会成为AML MRD检测的专家了。Believe Me！


原文：https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTM2OTh8MDUzZGI0Yzd8MTcxNjA2NTMzN3wwfA%3D%3D

参考文献：
Xu Jie,Jorgensen Jeffrey L,Wang Sa A. How Do We Use Multicolor Flow Cytometry to Detect Minimal Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia?[J] .Clin. Lab. Med., 2017, 37(4): 787-802.