糖摄取、线粒体质量、线粒体膜电位、活性氧，流式都能测

niwanmao

淋巴细胞活化时，糖酵解和线粒体氧化磷酸化（OxPhos）会发生上调。

但在B细胞和T细胞之间以及调节性T细胞亚群内，这些代谢的变化均不相同。例如，小鼠脾脏初始CD4 + T细胞受CD3/CD28刺激后，糖酵解和葡萄糖摄取水平上调，从而表现出糖酵解与OxPhos的比率增高。相反，B细胞受LPS和抗B细胞受体刺激后，糖酵解和OxPhos均会上调，于是糖酵解/ OxPhos比率与静息B细胞无明显变化。

另外，细胞代谢过程中，会产生ROS。高水平的ROS可通过直接诱导单链和双链DNA断裂，或通过氧化脂肪酸、蛋白质中的氨基酸或酶促辅因子，来引起细胞氧化应激。然而，在低含量和含氧量正常的条件下，ROS代表重要的细胞信号传导分子。例如，在干细胞中，ROS作为第二信使来确保细胞的再生。

许多蛋白质是氧化还原传感器。例如，半胱氨酸的氧化使PTEN或Akt失活，这与B细胞发育密切相关；参与抗体类别转换重组的Bach2是一种氧化还原敏感的转录因子。

因此，免疫细胞代谢包括ROS、糖酵解和线粒体活性，其与信号传导途径交叉，检测免疫细胞的代谢可反映其激活状态，并能预测免疫细胞的命运。

实时测量糖酵解和线粒体活性的金标准是通过使用Seahorse装置， 然而，这个实验设置需要访问昂贵的设备和大量的细胞（每个实验～2×10E6），并且无法区分亚群。

于是，流式细胞术现身了。

流式能检测哪些代谢指标？

（1）葡萄糖摄取（6-NBDG; 6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose）
可发出荧光的葡萄糖类似物6-NBDG用于直接追踪单糖被细胞摄取的行为。 通过在存在6-NBDG的无葡萄糖培养基中孵育细胞，这种类似物就可以代替葡萄糖积聚在细胞中。 该测定的特异性可以通过竞争性添加葡萄糖来验证。 必须注意的是，该测定不直接测量糖酵解（即丙酮酸或乳酸生产），只能测量葡萄糖摄取。

（2）线粒体质量（MitoTracker Green）
这是一种细胞渗透型的羰花青素结构衍生物，是一种亮绿色荧光探针（激发波长490 nm，发射波长516 nm），其在水溶液中几乎不发荧光，只有当聚集在线粒体的脂质环境才能发荧光，并且其定位于线粒体的能力不受线粒体膜电位影响，一旦摄入细胞就不容易被洗涤掉。通过标准化细胞数量、染料浓度和孵育时间，能够实现线粒体质量的半定量检测。

（3）线粒体膜电位（mtmP）（DIOC6; 3,3-dihexyloxacarbocyanine iodide; TMRE;tetramethylrhodamine）
DIOC6、TMRE这两种染料虽然也能和MitoTracker一样标记线粒体，但与线粒体膜电位密切相关，所以其结合后的荧光强度，反映出线粒体膜电位高低。

下图为利用TMRE监测线粒体膜电位随时间变化的曲线图，可见经过CCCP处理的阳性对照（绿色曲线），线粒体膜电位随时间快速降低：



（4）ROS（DCFDA; 2-7-dichlorodihydrofluorescein

diacetate）。

在淋巴细胞中，ROS的主要来源是呼吸链复合物I和III。 荧光染料DCFDA可检测细胞各类ROS，不论其来源。 在细胞内，DCFDA首先脱乙酰化，但不发射荧光直至被ROS氧化成DCF（2α,7β-二氯荧光素）。 值得注意的是，探针虽然对特定的ROS物种没有选择性，但在其他氧化酶和Fe2 +等因子的存在下容易出现。

下图为DCFDA检测线粒体膜电位的实验结果，红色曲线为加了0.01％过氧二硫酸铵（APS），荧光强度增高，绿色曲线为0.01％APS＋维生素C还原，使得DCFDA荧光强度重新降低：



结合细胞表面标记，就可以在复杂细胞群体中，选择出相应的亚群进行代谢指标评估。

以下是各种染料常见的供应商、溶剂、工作液浓度、储存温度





参考文献：
Cossarizza Andrea,Chang Hyun-Dong,Radbruch Andreas et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies.[J] .Eur. J. Immunol., 2017, 47(10): 1584-1797.