细胞周期，G1期比例很大，S期很少，没有预期的周期阻滞...

YGYL

各位老师，我想请教一个问题，我的实验是用病毒刺激无脊椎动物，抽血做流式检测细胞周期，看是否会有周期阻滞现象，但是用modfit软件分析后发现数据几乎没变化，G1期峰值很高，S期很少，没有预期周期阻滞的现象，感觉图不对，我不知道是不是我modfit分析的时候出现问题还是流式上机的时候出现问

设参数PE-2A

最后形成的图片

这是我用软件分析FCS文件数据的一个简单过程，我不知道是不是在选择的参数问题？整个实验我是用没处理的无脊椎动物血细胞作为阴性对照来设区域这是我的阴性对照

阴性设阈值

这是我的实验组，最后一个图会显得很奇怪，像这张一样，感觉突然剧增

我放大之后是下面这样：

但是我的阴性组这个图就看不到了：

所以我不知道是我流式的时候出错了还是分析的时候出现错误？文件有我的流式导出的FCS文件，麻烦各位老师帮忙指导一下，十分感谢！

niwanmao

看C6上的图，似乎PE的坐标是LOG的，并且最后你的细胞荧光位置在很高的10E5.1～10E5.8区域，而且分布很怪。
你的标本处理步骤能否先说明一下？理顺样本处理之后，然后在获取的时，将PE通道设置为线性模式获取。

YGYL

谢谢老师，我标本处理步骤如下：
1：抽血于1.5EP管（750ml抗凝剂），800g离心5min;收集细胞（残留50UL左右液体），加1mLEDTA抗凝剂，用1mL枪头吹打分散细胞，500g离心5分钟；
2：弃上清（残留50UL左右液体），1mL-20度预冷70%乙醇固定细胞，轻轻吹打，-20度温4h
3:350g离心10min,弃上清（残留50UL左右液体）加入预冷EDTA抗凝剂，重悬细胞，350g离心5min,PI染色（PI试剂盒）
4：0.5mL配好的PI染色剂，37度避光温浴30min,随后过滤膜，放冰上上机跑样。用的流式细胞仪是BDc6的机器跑的，阴性对照是没有处理过没有染色的血样！

niwanmao

YGYL 发表于 2017-12-24 15:01
谢谢老师，我标本处理步骤如下：
1：抽血于1.5EP管（750ml抗凝剂），800g离心5min;收集细胞（残留50UL左右 ...

1ml EDTA抗凝剂有没有参考其它文献还是自己随便加的？按道理这么大的量应该容易造成影响细胞或造成细胞死亡的吧。
第2步一般乙醇固定24小时。
第3步，为什么仍加EDTA抗凝剂，而不是PBS？
另外，不知道你在哪一步裂解红细胞，似乎没看到。

YGYL

谢谢老师指导，我的实验对象是青蟹，没有红细胞，观察细胞周期需要裂解红细胞吗？加EDTA抗凝剂是实验室师姐的经验说效果比较好，因为螃蟹血细胞很容易破碎，所以说第三步把PBS替换掉，按照老师您的看法主要问题是出在EDTA抗凝剂这几点吗？我换成PBS试试看

YGYL

老师还有一个问题，因为低转速很难离心得到细胞，我的800g离心会不会对细胞造成很大伤害，还有我用枪头吹打这些有没有很大问题？

YGYL

老师，还问一个问题，细胞周期（PI）是不用做阴性对照的是吗？

niwanmao

YGYL 发表于 2017-12-25 15:08
谢谢老师指导，我的实验对象是青蟹，没有红细胞，观察细胞周期需要裂解红细胞吗？加EDTA抗凝剂是实验室师姐 ...

哦青蟹应该是海洋生物，那么渗透压是不一样的，是不能用PBS的，你尝试用3％氯化钠溶液试试？
另外，裂解红细胞的话，对于青蟹，我们没有经验，不过EDTA在人类样本上，会造成白细胞破坏，不知道对于青蟹会不会。

niwanmao

YGYL 发表于 2017-12-25 17:18
老师，还问一个问题，细胞周期（PI）是不用做阴性对照的是吗？

细胞周期所谓的阴性对照就是未进行处理的正常螃蟹。

YGYL

好的谢谢老师您