BD测周期为什么G2期峰特别高

落花微雨

各位老师，我检测细胞周期时出现了如下问题：（1）对照组和药物低剂量组的G2峰异常高都比G1峰还高这是为什么？请问如何解决和避免？
（2）我的S期细胞也特别少，是否是因为我给药期间细胞已经长满了，导致细胞不分裂了。
（3）我依照对照组的来圈门，如果只圈左下角那部分细胞，直方图中就没有S和G2期的细胞了，求问这时候应该怎么圈门？
感觉自己问题好多，求各位老师不吝赐教。其中细胞为A549，流式机器为BD Accuri C6，用的乙醇固定过夜法，试剂盒用的凯基的。

ghqiu09

落花微雨 发表于 2017-12-26 09:49
老师，刚刚把图缩小了一下，发现在fsc300万-1000万出现细胞团，但是圈中后，发现直方图就只剩下G2期了， ...

细胞周期不是标记DNA总量的来吗？那坐标轴不能是对数坐标轴吧，你把坐标轴改成线性的看看

niwanmao

看FSC/SSC图，怎么感觉细胞都碎了。是不是处理步骤上有问题？

ghqiu09

这里的肯定不是细胞的，细胞位置至少应该在fsc三四百万。你把图缩小再看看

落花微雨

niwanmao 发表于 2017-12-25 13:45
看FSC/SSC图，怎么感觉细胞都碎了。是不是处理步骤上有问题？

老师，处理过程是：胰酶消化吹下来收集到离心管中，用冷PBS洗涤并计数，加70%乙醇固定液是一滴一滴加进去的，然后用枪吹匀，但是不知道为什么乙醇固定过夜后再次离心收集细胞，发现细胞变少了很多（过夜前细胞离心的时候有一大团，固定后细胞团就变很小了）。乙醇固定过夜后用PBS洗涤然后加工作液体。
老师，我怀疑是不是转速也会有很大的影响，因为说明书上写收集细胞后PBS洗涤离心条件为2000rpm，5min；用PBS洗涤固定液离心条件为1000rpm，5min。这转速会不会太高了？还有乙醇固定细胞变少了很多是我没有注意到什么吗？流式小白，非常感谢老师！

落花微雨

ghqiu09 发表于 2017-12-26 08:55
这里的肯定不是细胞的，细胞位置至少应该在fsc三四百万。你把图缩小再看看 ...

老师，刚刚把图缩小了一下，发现在fsc300万-1000万出现细胞团，但是圈中后，发现直方图就只剩下G2期了，不知道究竟是哪里出问题了……

落花微雨

ghqiu09 发表于 2017-12-26 14:23
细胞周期不是标记DNA总量的来吗？那坐标轴不能是对数坐标轴吧，你把坐标轴改成线性的看看 ...

老师，按照您说的我调成线性G2期的异常峰就没有啦，真是非常感谢您！能不能再请问一下，周期内的细胞数为什么那么少，我收集的时候是1万个，是不是如果当时收集门内1万个细胞，周期内的细胞就会多起来？

ghqiu09

落花微雨 发表于 2017-12-26 15:02
老师，按照您说的我调成线性G2期的异常峰就没有啦，真是非常感谢您！能不能再请问一下，周期内的细胞数为 ...

具体应该收集多少个我也不懂，没做过。你收细胞的时候，可以把threshold调大一点（比如一百万），只要不影响你目的细胞就可以了。一万个events里面，你想想在小fsc那块有多少，所以，你这个细胞数少也就正常了。

niwanmao

落花微雨 发表于 2017-12-26 15:02
老师，按照您说的我调成线性G2期的异常峰就没有啦，真是非常感谢您！能不能再请问一下，周期内的细胞数为 ...

这样的坐标就对了。
细胞周期要求门内最好2万个以上。

落花微雨

ghqiu09 发表于 2017-12-26 15:21
具体应该收集多少个我也不懂，没做过。你收细胞的时候，可以把threshold调大一点（比如一百万），只要不 ...

好的，多谢老师啦