找回密码
 加入流式中文网

QQ登录

只需一步,快速开始

查看: 3381|回复: 5

[标本处理] 流式保存液与live/dead染料使用的先后顺序

[复制链接]
发表于 2017-12-26 14:09:43 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
组织提取的免疫细胞,因为不能及时的拿去流式上机,故用流失保存液保存。那赛默飞的那款LIVE/DEAD染料是在用保存液之前加,还是在标流式抗体后上机之前加?如果在保存液之前加的话,那再保存个一两周岂不是荧光都要淬灭了?
或者大家有没有更好的适用于我这种情况的去除死细胞干扰的方法?

组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2017-12-26 17:51:13 | 显示全部楼层
Live/Dead是适合于Fixable样本的那种吗?
那种染料在上机前加。

如果不是适合固定样本的死活染料,就不能用。
不过,其实通过FSC/SSC以及粘连体,基本上就够用的。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
 楼主| 发表于 2017-12-26 22:09:52 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-12-26 17:51
Live/Dead是适合于Fixable样本的那种吗?
那种染料在上机前加。

是用于fixable样本的,但是我看说明书都是说先将细胞用死活染料标记,然后用固定破膜液处理。
不知道您的细胞保存液与死活染料的顺序。
那按照您的意思,就是细胞保存液保存的细胞,先标表面的流式抗体,然后在染死活染料,然后去上机?
我们是组织中分离的细胞,总感觉不去一下死细胞,心里不踏实。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2017-12-27 14:44:24 | 显示全部楼层
飞鸿317 发表于 2017-12-26 22:09
是用于fixable样本的,但是我看说明书都是说先将细胞用死活染料标记,然后用固定破膜液处理。
不知道您的 ...

Live/Dead染料我们没有测试,仔细看了下说明书,从其原理看,可能不适合FlowGuard保存过的样本,因为我们测试过Annexin V,用FlowGuard保存后,会出现阳性,Live/Dead染料标记的是细胞膜内外侧的胺,所以原理上有点类似。
因为FlowGuard内含的成份除了保护以外,还有轻微固定作用,所以对于不能在FlowGuard保存后用这些染料。

我目前考虑的是两个解决方案:
1、你可以收集到后,先用Live/Dead标记30分钟,然后洗涤后,以PBS重悬,加入FlowGuard保存液,最后保存在4度,只要避光措施到位,根据我平时染其它抗体的经验,3天~1周问题不大,更长时间,还是需要测试过才行。
2、放弃Live/Dead,改用FSC/SSC散点图排除死细胞和凋亡细胞,用CD45/FSC排除红细胞和碎片 ,FSC-H/FSC-W排除粘连体,这样子,其实起到跟用Live/Dead相同的效果。不用Live/Dead的文章还是相当多的。

最后要提一下的是,如果你在组织解离时,使用了酶消化,那么无论怎么保存,Live/Dead都是可能出现假阳性的,因为其原理跟Annexin V染料有点类似。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2017-12-27 16:19:16 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-12-27 14:44
Live/Dead染料我们没有测试,仔细看了下说明书,从其原理看,可能 不适合FlowGuard保存过的样本,因为我们 ...

谢谢倪老师的建议
但是对于您最后一句话不是特别懂,消化酶对于染死活细胞假阳性的影响是因为什么呢?
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2017-12-27 18:11:53 | 显示全部楼层
飞鸿317 发表于 2017-12-27 16:19
谢谢倪老师的建议
但是对于您最后一句话不是特别懂,消化酶对于染死活细胞假阳性的影响是因为什么呢? ...

做贴壁细胞的时候,你会体会很深的,贴壁细胞用酶消化后,容易导致细胞膜被破坏,导致染料容易进入细胞,细胞膜内侧的物质(例如Annexin V,当然也会包括他们Live/dead的目标胺类物质)容易被染料标记上
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2025-3-14 18:17

Powered by Discuz! X3.5

© 2001-2025 Discuz! Team.

快速回复 返回顶部 返回列表