流式保存液与live/dead染料使用的先后顺序

飞鸿317

组织提取的免疫细胞，因为不能及时的拿去流式上机，故用流失保存液保存。那赛默飞的那款LIVE/DEAD染料是在用保存液之前加，还是在标流式抗体后上机之前加？如果在保存液之前加的话，那再保存个一两周岂不是荧光都要淬灭了？
或者大家有没有更好的适用于我这种情况的去除死细胞干扰的方法？

niwanmao

Live/Dead是适合于Fixable样本的那种吗？
那种染料在上机前加。

如果不是适合固定样本的死活染料，就不能用。
不过，其实通过FSC/SSC以及粘连体，基本上就够用的。

飞鸿317

niwanmao 发表于 2017-12-26 17:51
Live/Dead是适合于Fixable样本的那种吗？
那种染料在上机前加。

是用于fixable样本的，但是我看说明书都是说先将细胞用死活染料标记，然后用固定破膜液处理。
不知道您的细胞保存液与死活染料的顺序。
那按照您的意思，就是细胞保存液保存的细胞，先标表面的流式抗体，然后在染死活染料，然后去上机？
我们是组织中分离的细胞，总感觉不去一下死细胞，心里不踏实。

niwanmao

飞鸿317 发表于 2017-12-26 22:09
是用于fixable样本的，但是我看说明书都是说先将细胞用死活染料标记，然后用固定破膜液处理。
不知道您的 ...

Live/Dead染料我们没有测试，仔细看了下说明书，从其原理看，可能不适合FlowGuard保存过的样本，因为我们测试过Annexin V，用FlowGuard保存后，会出现阳性，Live/Dead染料标记的是细胞膜内外侧的胺，所以原理上有点类似。
因为FlowGuard内含的成份除了保护以外，还有轻微固定作用，所以对于不能在FlowGuard保存后用这些染料。

我目前考虑的是两个解决方案：
1、你可以收集到后，先用Live/Dead标记30分钟，然后洗涤后，以PBS重悬，加入FlowGuard保存液，最后保存在4度，只要避光措施到位，根据我平时染其它抗体的经验，3天～1周问题不大，更长时间，还是需要测试过才行。
2、放弃Live/Dead，改用FSC/SSC散点图排除死细胞和凋亡细胞，用CD45/FSC排除红细胞和碎片 ，FSC-H/FSC-W排除粘连体，这样子，其实起到跟用Live/Dead相同的效果。不用Live/Dead的文章还是相当多的。

最后要提一下的是，如果你在组织解离时，使用了酶消化，那么无论怎么保存，Live/Dead都是可能出现假阳性的，因为其原理跟Annexin V染料有点类似。

飞鸿317

niwanmao 发表于 2017-12-27 14:44
Live/Dead染料我们没有测试，仔细看了下说明书，从其原理看，可能 不适合FlowGuard保存过的样本，因为我们 ...

谢谢倪老师的建议
但是对于您最后一句话不是特别懂，消化酶对于染死活细胞假阳性的影响是因为什么呢？

niwanmao

飞鸿317 发表于 2017-12-27 16:19
谢谢倪老师的建议
但是对于您最后一句话不是特别懂，消化酶对于染死活细胞假阳性的影响是因为什么呢？ ...

做贴壁细胞的时候，你会体会很深的，贴壁细胞用酶消化后，容易导致细胞膜被破坏，导致染料容易进入细胞，细胞膜内侧的物质（例如Annexin V，当然也会包括他们Live/dead的目标胺类物质）容易被染料标记上