细胞凋亡结果

juanjuan

各位老师，我用的是HepG2贴壁细胞

操作过程如下：

1.     细胞未进行任何处理（不加药）。去除培养基，用PBS洗一遍。再用刮刀把细胞刮下来，加入PBS吹打后，200g离心3min，洗两次。

2.     用双蒸水稀释5 × Binding Buffer为1 × 工作液，取500 μl 1 × Binding Buffer重悬细胞。

3.     每管加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI。

4.     混匀后，室温避光孵育5分钟。

5.     上机检测

计数3万个细胞。

但是看了结果，怎么觉得都死了？

流式新手，一脸懵逼，请老师指点一下。谢谢

robert1988

niwanmao 发表于 2018-2-14 08:21
哦，确认一下Trypsin胰蛋白酶的浓度，前面写了两个，一个是0.02％，一个是0.05％，请问一下你用的是哪个 ...

应该是0.25%或者0.05%， 我都用过，0.05%的更好控制一些，我比较倾向0.05%， 我养的多数是endothelial cells，所以铁壁不是特别牢。当然也要根据不同细胞调整，起码要能消化下来。

niwanmao

是的，看FSC和SSC，以及染色结果，应该是都碎了。

tiger

不要刮，要消化。

robert1988

刮死了，可以用0.02% Trypsin 处理，显微镜下密切关注，然后及时用血清终止消化，将消化过的细胞离心收集，[用原培养基重选，37度 Rotating 孵育45分钟恢复表面抗原]，如果检测Annexin V, [  ] 里面的可省略。

niwanmao

robert1988 发表于 2018-2-8 23:58
刮死了，可以用0.02% Trypsin 处理，显微镜下密切关注，然后及时用血清终止消化，将消化过的细胞离心收集， ...

robert在贴壁细胞上测试过效果如何？好像养贴壁细胞很多同学都提到此类问题。

robert1988

niwanmao 发表于 2018-2-9 11:11
robert在贴壁细胞上测试过效果如何？好像养贴壁细胞很多同学都提到此类问题。 ...

效果很好，复原时间根据消化难易程度决定，一般0.05% Tripsin 处理5分钟的， 对应45分钟复原。

niwanmao

robert1988 发表于 2018-2-9 21:30
效果很好，复原时间根据消化难易程度决定，一般0.05% Tripsin 处理5分钟的， 对应45分钟复原。 ...

@robert1988 兄 有空的时候放几张分析结果上来分享一下，很好的技巧，可以帮助很多站友解决此类难题。

robert1988

niwanmao 发表于 2018-2-10 08:55
@robert1988 兄 有空的时候放几张分析结果上来分享一下，很好的技巧，可以帮助很多站友解决此类难题。 ...

时间有点久了，阴性的图不好找了。这么说吧，我有种表面抗原，如果Tripsin处理3到5分钟，然后PBS+FBS或者FCR blocker 孵育，然后染色，基本上抗原检测不到，如果按照所述方法孵育复原，90%以上的细胞为阳性。时间太久，图难找，见谅。

niwanmao

robert1988 发表于 2018-2-13 02:07
时间有点久了，阴性的图不好找了。这么说吧，我有种表面抗原，如果Tripsin处理3到5分钟，然后PBS+FBS或者 ...

@robert1988 兄，不是说检测抗原，是指贴壁细胞的Annexin V、PI凋亡散点图，因为很多研究生做出来贴壁细胞的AV/PI双阳性信号特别多，用你说的方法，是否可以避免这些情况？