流式多色检测，管数准备问题

Veblen

老师好，想请教一下如果我做人T淋巴细胞十三色染色，主要检测Tregs， TEM, TCM, Naive T, T effector,Th1 Th2 Th17等指标；1. 那么除了真正检测的样本管、空白管、以及准备每个分子的单染管用于调补偿（一共13管），那么画门我需要准备哪些管呢？（是不是将所有同型对照抗体加入同一管中用于各个分子的画门，还是加入Fc block就可以了？）
2. 希望懂的老师讲解一下，关键就是确定门的位置，我还需要准备哪些管？
十分感谢，新年快乐。

niwanmao

首先需要将你的方案放出来，才能知道哪些抗体的区分度欠佳的，才需要采用FMO确定设门位置，至于补偿，完全可以用正常内对照进行设置，不需要单染补偿。

whyxa

首先你有十三个颜色，做FMO的话很费抗体，我的回答是：1，unstained ，2-14，13个单染管， 15，样品管，16，all isotype inside  。

先用少量标本1-14管，调节FCS,SSC及各个荧光单染的电压，电压固定后在调节补偿，开始调节补偿后，电压就不要动了，指的是荧光电压，不是FSC,SSC。

2-14 管调节补偿，用少量15 样品管，测试一下补偿调节是否合适，进行微调。

whyxa

门确定位置很简单，也就是FOXP3，CD25及IL-17等一些细胞因子不好确定外，其他不需要做对照确定，对于连续性表达的确定可以通过isotype确定，做的多了，一眼就看出来位置画在哪里合适，前提是你要了解你检测的因子的生物学特性和分布！

Veblen

whyxa 发表于 2018-2-20 02:11
门确定位置很简单，也就是FOXP3，CD25及IL-17等一些细胞因子不好确定外，其他不需要做对照确定，对于连续性 ...

谢谢老师，那FOXP3，CD25及IL-17门位置的确定还是依靠isotype吗

whyxa

Veblen 发表于 2018-2-21 07:15
谢谢老师，那FOXP3，CD25及IL-17门位置的确定还是依靠isotype吗

需要，但在我看来Isotype是做给别人看的，整理数据的时候需要有isotype的对照图，其实CD25,IL17 也是能够看出分界线的

Veblen

whyxa 发表于 2018-2-22 07:24
需要，但在我看来Isotype是做给别人看的，整理数据的时候需要有isotype的对照图，其实CD25,IL17 也是能够 ...

恩恩 所以门的位置的确定我们还是用Isotype对吧，什么时候才会用到FMO呢