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什么时候必须用甲醇破膜?注意点是什么?

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发表于 2018-3-12 16:45:13 | 显示全部楼层 |阅读模式

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很多时候,我们想破膜染胞内抗原,大多是采用多聚甲醛固定、Triton X-100破膜,但是对于某些抗原无论怎么样都做不出来,最常见的就是磷酸化蛋白系列。

幸运的是,有作者探索发现,用4度甲醇处理5~10分钟,可以磷酸化蛋白被检测到。但是,甲醇用多少浓度比较好?

先看50%甲醇的效果,p-STAT5与未染色对照相比,几乎没变化,而p-ERK和p-S6不错:
屏幕快照 2018-03-12 下午4.30.42.png


换成80%甲醇,p-STAT5效果明显,p-ERK效果仍不错,p-S6虽然能染出来,但MFI较50%甲醇的时候降低了大约20%:
屏幕快照 2018-03-12 下午4.30.48.png

所以,当你准备染胞内磷酸化蛋白时,首先要用甲醇破膜,其次,必须得进行预试验,了解你使用的浓度是否适合。说明一下,上面的阳性对照模型是用GM-CSF体外刺激正常人外周血单核细胞建立的。


另外补充一下,用甲醇破膜的时候,得关注你那些表面标记的MFI降低,从下图可见,单核细胞的CD14出现不同程度的降低,50%甲醇处理者MFI降低相对较好,而80%甲醇破膜者则降低显著:
屏幕快照 2018-03-12 下午4.39.55.png


凡事均有技巧,找到关键就能做好。




参考文献:
Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 2017 Oct;47(10):1584-1797. doi: 10.1002/eji.201646632.

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