流式双荧光染色

zy北极星

老师您好，我最近在做流式双荧光染色，我们发现所研究的病毒能够侵染鱼类白细胞，且发现白细胞上存在该病毒的受体蛋白，为了共定位白细胞上的病毒和受体蛋白，将白细胞提出来后孵育病毒的兔多抗和受体蛋白的鼠多抗，荧光二抗用的是Dylight 488 羊抗兔和Dylight 488 羊抗鼠，两种一抗和二抗混合在一起孵育细胞，也做过先孵育受体的一抗和二抗然后孵育病毒的一抗和二抗，但是流式结果出来的图如图所示，从左到右分别对应的是：病毒单染、受体蛋白单染、病毒和受体蛋白双染。理论上病毒感染细胞是一个动态的过程，不会在某个时间点所有含有受体的细胞都被病毒感染，也就是说第三张图片中第四象限共染的那部分细胞不正常，因为至少应该存在受体蛋白单染的一部分细胞，我对流式了解的不是很多，希望老师能帮我提出问题，解答疑惑，万分感谢！

niwanmao

你两种二抗都是Dylight488，为什么选了两个通道检测？

zy北极星

抱歉抱歉,搞错了 , 是Dylight649羊抗兔 , 不是488羊抗兔 , 所以荧光通道是两个

zy北极星

niwanmao 发表于 2018-3-13 09:18
你两种二抗都是Dylight488，为什么选了两个通道检测？

抱歉抱歉,搞错了 , 是Dylight649羊抗兔 , 不是488羊抗兔 , 所以荧光通道是两个

zy北极星

zy北极星 发表于 2018-3-13 14:28
抱歉抱歉,搞错了 , 是Dylight649羊抗兔 , 不是488羊抗兔 , 所以荧光通道是两个 ...

病毒的兔抗使用的是Dylight649羊抗兔二抗，受体蛋白的鼠抗使用的是Dylight488羊抗鼠二抗，两个二抗的激发波长不同，所以选择的是两个通道，只是我不知道为什么，两个抗体做单染的时候都是没有问题的，细胞分群很明显，但是两种抗体一起做双染就出现了如同对角线的共染细胞群，之前有看到过说这样对角线形状的细胞是死细胞，也有说两种抗体需要分开孵育，但是我试过抗体分开孵育，和一起孵育的情况一样，实在找不出原因，各路大神和老师给提提意见，多谢了~~~

niwanmao

zy北极星 发表于 2018-3-14 22:47
病毒的兔抗使用的是Dylight649羊抗兔二抗，受体蛋白的鼠抗使用的是Dylight488羊抗鼠二抗，两个二抗的激发 ...

那看来可能还是非特异性结合的问题了。
我建议你试试下面的步骤：
1、病毒一抗+受体一抗
2、488羊抗鼠
3、649羊抗兔

zy北极星

niwanmao 发表于 2018-3-15 20:29
那看来可能还是非特异性结合的问题了。
我建议你试试下面的步骤：
1、病毒一抗+受体一抗

谢谢老师的解答，我再试试看