用消化酶和淋巴细胞分离液分离肿瘤浸润淋巴细胞

cellprobe

我打算用胶原酶消化病人的肿瘤组织，再用淋巴细胞分离液把肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞分离开。
用淋巴细胞分离液分离以后，肿瘤细胞是在最上层吗？我从网上找了一张图，是这样的吗？请高人指教

niwanmao

最好肯定是通过流式分选或者磁珠分选，单纯用淋巴细胞分离液，肯定容易丢细胞。
如果只是分析，直接染色上机测即可。

a86856635

密度梯度离心以密度为准，原理虽然一样，不同的方法获取细胞的方法还是有差别的。可以直接配不同层数的密度梯度，直接吸取目的细胞。也可以先用低密度去除杂质和杂细胞再富集目的细胞。

cellprobe

a86856635 发表于 2018-3-29 16:23
密度梯度离心以密度为准，原理虽然一样，不同的方法获取细胞的方法还是有差别的。可以直接配不同层数的密度 ...

还不是很明白，我附件中的指示是对的吗？

cellprobe

niwanmao 发表于 2018-3-29 13:59
最好肯定是通过流式分选或者磁珠分选，单纯用淋巴细胞分离液，肯定容易丢细胞。
如果只是分析，直接染色上 ...

磁珠分选当然最好。我查到文章里面是这样写的：the above cell suspension was centrifuged at 1,500 rpm. The pellet was resuspended in 40% Percoll solution containing 100 U/ml heparin, and then loaded on the layer of 70% Percoll solution followed by centrifugation at 2,000 rpm for 20 min at room temperature。不是很明白。

这篇文章写的更详细。
https://bio-protocol.org/e892

能解释一下吗？

cellprobe

niwanmao 发表于 2018-3-29 13:59
最好肯定是通过流式分选或者磁珠分选，单纯用淋巴细胞分离液，肯定容易丢细胞。
如果只是分析，直接染色上 ...

这是不连续密度梯度离心分离TIL的原始文献： Suspensions of disaggre-gated tumors (generally in 5 ml of medium) were placed on top of the gradient formed by overlay- ing a cushion of 100% Ficoll-Hypaque (density 1.077, Pharmacia, Uppsala, Sweden) with an equal volume of 75% (v/v) Ficoll-Hypaque in RPMI 1640 (density, 1.055). Gradients (25 ml) were centrifuged at 800 × g for 20 min at room temperature, The MNC-enriched fractions which formed a distinct band at the interface between 75% and 100% Ficoll-Hypaque were collected, washed twice in fresh medium and counted in a hemacytometer. Tumor cells, which formed the upper band on top of 75% Ficoll-Hypaque were also collected.

我可以这么翻译吗：离心管中先加入10毫升100% Ficoll，然后再加入10毫升用1640或者生理盐水稀释的75%Ficoll，最后在上面加入5毫升的肿瘤细胞悬液，800 g离心20分钟。这样肿瘤细胞就在最上层了，是75%Ficoll的上表面，TIL就是在75%Ficoll和100%Ficoll之间了是吗？
和附件中的图片所示一致。

800g速度太高，我一般是400g离心30分钟。

niwanmao

cellprobe 发表于 2018-3-30 00:53
这是不连续密度梯度离心分离TIL的原始文献： Suspensions of disaggre-gated tumors (generally in 5 ml  ...

密度梯度离心分离TIL没试过，如果要试，我觉得还是先严格按照Protocol里面的试，离心速度也不要更改，否则会影响分离效果。

cellprobe

niwanmao 发表于 2018-3-30 13:13
密度梯度离心分离TIL没试过，如果要试，我觉得还是先严格按照Protocol里面的试，离心速度也不要更改，否 ...

我没有严格按照protocol做，我失败了，我的离心转速和时间不是这个。文章里面是800g20分钟，我是2000rpm 20分钟。难道是因为没有严格按照protocol。我没有把肿瘤细胞和TIL分开，我把细胞分成两份，一份是用肿瘤细胞培养基培养，一份是用肿瘤浸润淋巴细胞培养基培养的，希望能把细胞筛选出来。

chevalierx

2000rpm的转速有点低了，密度梯度离心的确是可以高转速的，分离液本身能起到保护的作用。

zhenghua20

肿瘤细胞应该在管子的最底部，不应该在最上面的，til的位置应该是对的。