血管内皮细胞及其亚群检测的优化

niwanmao

血管生成在各种实体瘤的发展中起着至关重要的作用，抗血管生成疗法是癌症治疗的一种新型方式。然而，并非所有治疗的患者都从抗癌药物治疗中受益，这表明需要可靠的生物标志物来预测患者对治疗药物的反应和评估预后。以前的研究表明，循环内皮细胞（CECs）及其亚群可能成为潜在的癌症治疗的生物标志物。

CECs是具有内皮特征的外周血稀有细胞群。基于生物学状态，可能在外周血中检测到几个CEC亚群。这些CEC亚群包括成熟的CECs（mCECs）、静息和活化的CECs（分别为rCECs和aCECs）和内皮祖细胞（EPCs）， CECs有助于血管生成，并且在各种恶性肿瘤患者中比例增加。 Kraan等回顾了CECs在癌症治疗中的潜在临床应用，对于某些恶性肿瘤，基线CEC水平以及治疗期间CEC的变化可准确预测抗血管生成治疗效果。 CECs及其亚群在前列腺癌、结直肠癌和肺癌患者的抗血管生成治疗中的预后价值也非常高。

然而，由于过去几十年不同临床研究报告的不一致，CECs的作用仍然存在争议。例如，一些研究报道了非小细胞肺癌患者的基线CEC水平与无进展生存期（PFS）之间的相关性。 Kawaishi等人指出，基线CEC数较高的患者PFS较长，而Ilie等人认为高基线CEC计数与较短PFS显著相关。另一方面，一些研究人员证明，基线CEC水平之间无显着相关性和PFS。这些相互矛盾的报告可能是由于研究对象缺乏统一性，包括样本数量、患者治疗和疾病分期，但最重要的是，关于CEC及其亚群的免疫表型和检测几乎没有共识。因此，建立一种可靠的CEC检测和识别方法势在必行。

在临床研究中，多参数流式细胞术经常被广泛用于CEC及其亚群的计数，但是，它需要严格的操作来最大化信噪比。大量已发表的文献均未能全面解决检测中各方面的关键技术问题以及排除可能降低客观信号和增强背景噪声的潜在因素。

为此，在2018年3月8日的Cancer Manag Res.上，暨南大学的Fangbin Zhou等人对CEC计数每一步的影响因素进行了细致分析，包括分析前因素、流式细胞仪方法（FCM）数据采集和分析，对我们帮助不小。


1、采样和抗凝剂
采血时，去除最开始的2ml血，以避免由于穿刺导致内皮细胞释放增多。
抗凝剂，作者对比了EDTA、ACD和肝素，发现绝对计数没有显著差异。



2、抗体滴定
抗体滴定结果如下图，彩色的点是厂家推荐的剂量，可见在CD106、CD133等抗体上，该用量并非最佳量。（不过流式中文网插一句，一般滴度曲线出现忽上忽下的折线型变化的可能性比较小，怀疑CD133和KDR的折线变化可能还是由于阳性细胞量数量少）



3、裂解/洗涤还是裂解/免洗
免洗，是为了避免丢失细胞，但免洗又会导致信噪比降低。所以需要进行对比评估。从下图对比看，两者差异不明显。



4、样本保存时间问题
作者对比了新鲜样本和样本在4度保存24、48小时的三次结果，发现24小时就变化明显。因此，对于CEC检测，样本的时间效度明显影响该应用的普及。


在此，流式中文网插一句，国外有文章采用Transfix保存液以延长保存时间，而实际上咱们流式中文网自己原研的FlowGuard®保存液，也能起到同样的作用。

5、流式数据获取
至少获取1～2×10E6细胞，以保证统计的有效性。作者对比了0.5和1ml两个体积获取10E6细胞的检测结果，发现0.5ml血足够用，不过还是存在变异。


6、FMO对照
同型对照的非特异性结合信号仍显著，尤其是串联染料。FMO对照还是更合适。



7、方案
尽管抗体越多越好，但也需要考虑到性价比，作者认为，CD45、CD34、CD133、CD146、CD106五个抗体足够区分。流式中文网插一句，其实再加个死活染料，例如PI或7-AAD，会更好。


8、设门方法
推荐如下：



9、不同次检测之间的可重复性
采用上述优化的步骤和方案、设门方法，不同次之间的可重复性很高：



10、癌症患者和健康人之间的数据对比


另外插一幅《Detection and Validation of Circulating Endothelial Cells, a Blood-based Diagnostic Marker of Acute Myocardial Infarction》中的一幅急性心肌梗塞患者与健康人CEC对比图。


CEC的应用范围很广，但只有做标准了，才能使结果准确可靠，才能真正应用于临床的诊断。


参考文献：
Zhou F, Zhou Y, Yang M, et al. Optimized multiparametric flow cytometric analysis of circulating endothelial cells and their subpopulations in peripheral blood of patients with solid tumors: a technical analysis. Cancer Manag Res. 2018 Mar 8;10:447-464. doi: 10.2147/CMAR.S157837.