FasL检测

jiezhuaph · 发表于 2018-4-15 21:01:33

有染过CD8+T细胞上FasL的小伙伴吗？请教一下哪种克隆的抗体好，另外有没有protocol可以指导一下具体操作。多谢！

niwanmao · 发表于 2018-4-17 08:44:27

检测人的还是检测小鼠的？

jiezhuaph · 发表于 2018-4-17 16:05:52

niwanmao 发表于 2018-4-17 08:44
检测人的还是检测小鼠的？

Human CD8+ T cells from PBMC negative isolation

niwanmao · 发表于 2018-4-18 19:28:18

jiezhuaph 发表于 2018-4-17 16:05
Human CD8+ T cells from PBMC negative isolation

FasL就是CD178，表达在细胞表面，所以很好做。
你可以将CD3、CD8、CD178一起标记，然后分析CD3＋CD8＋表面的CD178表达即可。至于克隆号，从发表文章看，NOK-1克隆号似乎引用量稍微高一点。

jiezhuaph · 发表于 2018-4-19 22:22:52

niwanmao 发表于 2018-4-18 19:28
FasL就是CD178，表达在细胞表面，所以很好做。
你可以将CD3、CD8、CD178一起标记，然后分析CD3＋CD8＋表面 ...

谢谢！标记了CD3，CD8，CD178NOK-1克隆，但CD178信号看上去比较弱，阳性信号不到10*3 ，CD8是用CD3/CD28 beads刺激了48小时后的

niwanmao · 发表于 2018-4-20 07:52:37

jiezhuaph 发表于 2018-4-19 22:22
谢谢！标记了CD3，CD8，CD178NOK-1克隆，但CD178信号看上去比较弱，阳性信号不到10*3 ，CD8是用CD3/CD28 ...

从文献数据、抗体说明书的数据来看，确实是偏弱的，不分群，所以做好阴性参照很重要，建议对照管和实验管均进行Fc阻断后，对照管用CD3、CD8做一管FMO对照，这样分析会比较准确。

Arcrain · 发表于 2018-4-21 09:07:13

FasL表达水平本身就很弱（要是高表达，细胞还活不活了？）。除了细胞表面，FasL也存在于细胞质中（所以，理论上，信号弱的话可以尝试一下胞内染色。我没做过！）。活化的T细胞FasL表达量会增加。细胞与metalloprotease抑制剂共孵育，可以抑制FasL的剪切，增加其在细胞表面的水平。

jiezhuaph · 发表于 2018-4-21 19:13:13

Arcrain 发表于 2018-4-21 09:07
FasL表达水平本身就很弱（要是高表达，细胞还活不活了？）。除了细胞表面，FasL也存在于细胞质中（所以，理 ...

我也想到了，细胞打了孔后，再测发现有一点shift，加抑制剂还没试

niwanmao · 发表于 2018-4-22 16:13:50

jiezhuaph 发表于 2018-4-21 19:13
我也想到了，细胞打了孔后，再测发现有一点shift，加抑制剂还没试

破膜后，都会发生偏移的，不一定是真正的增高，需注意做好我前面提到的对照

jiezhuaph · 发表于 2018-4-24 14:59:42

niwanmao 发表于 2018-4-22 16:13
破膜后，都会发生偏移的，不一定是真正的增高，需注意做好我前面提到的对照 ...

不打孔，加靶细胞刺激CD8表达FASL可不可以?

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