哮喘的气道纤维化，流式来定量

niwanmao

气道纤维化是哮喘的一个突出特征，涉及到哮喘的预后。气道中的纤维化是由于胶原沉积在上皮下组织的网状层造成的，而肌纤维母细胞是参与胶原蛋白沉积的主要细胞类型。现有的胶原沉积定量方法存在各种问题，最重要的是它们无法量化气道肌纤维母细胞中的胶原生物合成水平。

2018年4月16日的Cytometry A杂志上，Reichard A等人介绍了用流式来定量检测哮喘小鼠模型的肺中肌纤维母细胞胶原蛋白表达的新方法。

对象
8～12周大的C57BL/6雌性小鼠，以标准室内尘螨方法建立哮喘模型。

肺单细胞悬液分离
分离小鼠肺组织，然后用2.5ml消化缓冲液（含100 mg/ml Dispase II、10 mg/ml Collagenase A、1500 kU/ml DNase I和0.025 M CaCl2）消化，37度在轨道振荡器上孵育1小时。悬液用枪头轻轻吹打混匀，继续孵育30分钟，接着通过40um滤网过滤，900g离心5分钟去上清。收集的细胞团块，以死活染料染好之后，PBS重悬，900g离心5分钟去上清，最后以4％多聚甲醛固定10分钟。固定后的样本如果要进行下一步抗体标记，则需PBS洗涤后再标记，如果冻存，则可直接冻存。

抗体染色
细胞首先用50ul阻断缓冲液阻断10分钟（含 未结合荧光素的anti-CD16/CD32、0.1％皂素、1％BSA），接着加入50ul目标抗体混合物：anti-CD45-Alexa Fluor 700（ Clone: 30-F11）、anti-aSMA-FITC（Clone: 1A4）、无荧光素的anticollagen-I（Polyclonal），该抗体混合物中也含有0.1％皂素和1％BSA。避光孵育30分钟后，500g离心5分钟去上清，然后加入50ul APC标记的二抗，继续孵育30分钟。最后再次离心去上清，以100ul鞘液重悬，上机获取。

分析结果
分析图形如下，先用Time/SSC找出液流稳定部分，接着用FSC-A/FSC-H排除粘连体，再之后通过FSC/SSC排除掉碎片，这三步在任何与细胞有关的实验中，基本上都是常规。接着通过CD45/死活染料散点图，选择CD45－死活染料－的细胞，也就是活的非造血细胞，再接着，选择αSMA+肌纤维母细胞，分析其中Collagen-I高表达、中等表达、弱或阴性三个强度的比例，Collagen-I的阳性和阴性分界通过FMO来确定。



从下表的统计结果看，很明显，在哮喘动物中，高表达Collagen-I的肌纤维母细胞比例和绝对数均明显增高，中等表达者略减少，这表明在哮喘发生时，肌纤维母细胞中的Collagen-I可能由中等表达向高表达演变。



这项研究有什么意义？作者认通过流式检测的技术量化肌纤维母细胞的胶原合成，将有助于更早评估对细胞外重塑的治疗效果，而不必等到疾病晚期阶段才能观察到细胞外基质中胶原沉积的变化。临床上能用吗？呼吸科医生可以参考一下。


参考文献：
Reichard A, Wanner N, Stuehr E, Alemagno M, Weiss K, Queisser K, Erzurum S, Asosingh K. Quantification of airway fibrosis in asthma by flow cytometry. Cytometry A. 2018 Apr 16. doi: 10.1002/cyto.a.23373.