流式检测金黄色葡萄球菌的ROS

klutzl

实验步骤如下：

1、将1mM和10mM 的H2O2与细菌共培养3h后， 4℃ 12000 g离心15 min沉降细菌，PBS重悬，少量，用枪慢慢吹打清洗细菌。

2、  4℃ 12000 g离心弃上清，PBS清洗1-2次。

3、 加入100ul终浓度为10uM的DCFH-DA，37℃ 5% CO2培养箱中静置0.5 h，每隔5min混匀一下，使探针和细菌充分作用。（DCFH-DA为碧云天的试剂盒）

4、 4℃ 12000 g离心弃上清，用预热的PBS液洗涤细菌3次，去除未进入细菌内的DCFH-DA。

5、500ul PBS重悬，上流式细胞仪检测ROS。激发光488nm，发射光 525nm，选择FL1通道进行检测，检测细菌数目为50000个。

困惑：

1、Blank组和1mMH2O2和10mM H2O2的荧光强度也没有差别，一般来说用H2O2刺激后均会产生ROS，但是在这次实验中并未发现荧光变强。

2、由于细菌和细胞的结构不一致，是否需要对细菌进行破壁处理，才能使探针进入细菌？

3、实验步骤是否有不恰当的地方，谢谢。

4、第一个小峰代表什么？

niwanmao

细菌没做过，从相关的文献实验方法来看，你可以考虑延长孵育时间至1小时看看：
https://www.hindawi.com/journals/bmri/2014/753419/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5566361/#__sec6title

另外，请将未加染料的散点图和处理过的散点图同时放出来看看，设门建议还是先通过FSC/SSC来进行。前面的小峰可能就是因为一些异常信号的掺入。

klutzl

niwanmao 发表于 2018-5-14 22:31
细菌没做过，从相关的文献实验方法来看，你可以考虑延长孵育时间至1小时看看：
https://www.hindawi.com/jo ...

谢谢老师的回复，由于是第一次做细菌的流式，在设置实验的时候没有考虑周全，并没有设置未加染料这个组别，我打算过两天设置PBS组，未加染料的细菌组，细菌加染料，细菌加染料加过氧化氢刺激再进行上机检测看看结果怎么样。而且由于我们这边的检测老师也没做过细菌的，在圈门的时候也不知道该圈在哪个位置。

klutzl

niwanmao 发表于 2018-5-14 22:31
细菌没做过，从相关的文献实验方法来看，你可以考虑延长孵育时间至1小时看看：
https://www.hindawi.com/jo ...

老师，您好，我今天重新做了一批流式检测ROS的实验，但是结果仍然没有太大的区别。这次我用过氧化氢对金黄色葡萄球菌刺激18h后，离心，PBS清洗，加10um的DCF探针孵育30min，每隔5min混匀，离心，PBS清洗，500ulPBS重悬，上机，488/525nm进行检测。还是不太清楚问题出现在哪里，希望老师能够对我进行指导。谢谢。