percp-cy5.5和apc染料为什么能够共染？从流式仪结构上解释不通

immunology

本人实验室中的流式仪的型号是bd facsverse。在bd官网光谱查看器中查看默认滤光片的时候，发现有个问题解释不通。

如图，用635nm激光器激发apc染料，总发射荧光的22.4%（见括号1）可以被BD公司推荐的滤光片660/10所接收，但同时有总发射荧光的30%（见括号2）被percp-cy5.5的推荐滤光片700/54所接受，即apc漏光到percp-cy5.5通道的apc的荧光强度是30%。
此percp-cy5.5通道接受APC的荧光强度大于APC的本身通道接收的效率，虽然percp-cy5.5和apc不是一个激发光激发（一个488nm，一个635nm），但是在635nm激光激发的条件下，percp-cy5.5接收的apc荧光强度反而大，为什么apc和percp-cy5.5还能共染而不串光呢

robert1988

注意看第二列那个%Max, 在635nm激发下，PerCP-Cy5.5只有10.2%的发光强度，而APC则是73.7%。
而如果你换到488nm，就能看到PerCP激发强度为98.4%，APC只有1.1%。
你可以大概认为真正的信号比应该是APC：0.73*0.224， PerCP： 0.102*0.3，也就是635nm下，大概APC：PerCP=16:3，而488nm下，APC几乎不激发，这种情况完全在补偿可控范围。

immunology

robert1988 发表于 2018-5-16 22:14
注意看第二列那个%Max, 在635nm激发下，PerCP-Cy5.5只有10.2%的发光强度，而APC则是73.7%。
而如果你换到48 ...

首先感谢您的解答，您的意思我懂，我也考虑到了，我觉得您说的这个理论在这个表格横向比较是对的，横向指的是各荧光漏到这个滤光片 占各个荧光的比例，就算是漏到这个滤光片的百分比 比较大，只要是该波长的激光激发下，该荧光的激发效率低，那么也没有关系。

但是现在是纵向比较，在635nm的激发光下，确实有30%强度的apc进入了percp（percp-cy5.5）通道，即进入到该通道光电倍增管的光都应该认为是percp的，关键是现在是apc的光进入到了percp通道，并且还比本身通道的光要强。

robert1988

PerCP的接收器在蓝光488，红光激发的那部分不接收

immunology

robert1988 发表于 2018-5-16 23:20
PerCP的接收器在蓝光488，红光激发的那部分不接收

能具体讲一讲结构吗，或者有没有相关文献，我理解的是无论是488nm激发还是635nm激发，同一荧光走的滤光片不都是一个吗？比如我们实验室的verse就只按了一个七角型检测器，无论是488和635nm的激光激发出来荧光以后，都要走该检测器啊？

niwanmao

immunology 发表于 2018-5-16 23:30
能具体讲一讲结构吗，或者有没有相关文献，我理解的是无论是488nm激发还是635nm激发，同一荧光走的滤光片 ...

这跟光路结构设计有关，他们这些光路设计都是有专利的，可以将串色减到最小，所以这就是为什么同样的东西，不同公司生产出来的机器，其补偿值完全。
你们的配置是单激光？不应该啊，现在很少用单激光的吧。不同激发光走的是不同的通路的。

hezeljgouc

immunology 发表于 2018-5-16 23:30
能具体讲一讲结构吗，或者有没有相关文献，我理解的是无论是488nm激发还是635nm激发，同一荧光走的滤光片 ...

这个流式采集信号的策略有关，以BDaria分选机器为例，共有三根激光照射流动室，从上往下为红633，蓝488，紫405，这样单个细胞在液流里从上往下移动，会在不同的时间依次经过三根激光，三根激光激发产生的荧光信号也会在不同时间点被PMT检测到。BD以细胞经过蓝光的时间设为0，这样假设经过红光为-50ms（实际根据机器调整），经过紫光为50ms，软件将这三个时间点检测到的信号认为是一个细胞，这就是laser delay的概念。也就是说，percp-cy5.5的荧光信号是在经过488蓝光时激发并检测的，而apc染料同时被蓝光激发并被percp-cy5.5通道接收的信号才是你所说的“apc漏到percp-cy5.5的信号”，而488激发apc的效率很低，所产生的荧光信号也很弱。而我们分析数据看到apc的信号是在细胞经过633红光时激发并被检测到的，很强。相互比较一下，“apc漏到percp-cy5.5的信号（488激发）”比起真正的apc荧光信号（633激发）来说极弱，即补偿值很小。这也是被不同激光激发的荧光染料相互之间补偿值比较小的原因。

hezeljgouc

immunology 发表于 2018-5-16 23:30
能具体讲一讲结构吗，或者有没有相关文献，我理解的是无论是488nm激发还是635nm激发，同一荧光走的滤光片 ...

laser delay

immunology

hezeljgouc 发表于 2018-5-21 15:56
laser delay

您这句话我不太懂，“而apc染料同时被蓝光激发并被percp-cy5.5通道接收的信号才是你所说的“apc漏到percp-cy5.5的信号”，” 现在图上是 635红光 激发器激发的APC产生的荧光。
那635红光激发 APC产生的荧光不会漏到percp-cy5.5通道里面吗？

hezeljgouc

immunology 发表于 2018-5-25 20:17
您这句话我不太懂，“而apc染料同时被蓝光激发并被percp-cy5.5通道接收的信号才是你所说的“apc漏到percp ...

通道流式一般一根激光器对应一套PMT检测器（直列或8角或三角），比如BD Aria II红蓝紫三根激光有三套PMT。根据我现有知识的理解，一套PMT只记录其对应激光激发的荧光信号的机制应该是这样的：细胞依次经过红蓝紫三根激光，被蓝激光激发的荧光通过透镜和光纤同时被三套PMT检测到，但是软件只记录蓝激光对应通道（包括SSC，FITC,PE,Percp-cy5.5,PE-cy7等）的信号。根据laser delay，在-50ms时被红激光激发的信号，只记录其对应的通道（APC,A700,APC-cy7等）；而在50ms时被紫激光激发的信号，只记录相应通道（BV421,BV510,BV650）.最后软件把分别记录三根激光激发的信号整合到一起，才构成一个细胞所有通道的信号。这样就能够保证不同激光激发的荧光信号互相不干扰，这也是以前flower们常说的“不同激光器激发的荧光不溢漏”。但是我们在分析数据的时候确实也发现如Percp-cy5.5和APC之间确实有补偿，这是因为在记录Percp-cy5.5信号时Apc同时也被蓝激光激发了（虽然效率很低），也就有了我们分析数据时看到的“APC会漏到percp-cy5.5”。但是这不是你理解的APC被红激光激发的信号漏到了Percp-cy5.5，因为被红激光照射时软件根本不记录percp-cy5.5通道的荧光信号。