区分死细胞的染料在那个步骤添加

wdh1993

打算做THP-1来源的巨噬细胞的STAT6磷酸化，死细胞染料买的是BD Fixable Viability Stain 570试剂。请问：1.该试剂实在上机前进行死细胞染色么？
          2.另外，STAT6磷酸化的抗体（BD的）是否需要做Fc阻断呢？

niwanmao

1、FVS首先染，接着再进行表面抗体染色，再接着固定、破膜，染STAT6。
2、STAT6磷酸化抗体不需要Fc阻断，需做FMO对照。

wdh1993

niwanmao 发表于 2018-6-29 08:19
1、FVS首先染，接着再进行表面抗体染色，再接着固定、破膜，染STAT6。
2、STAT6磷酸化抗体不需要Fc阻断，需 ...

谢谢老师解答。
还想请问如果想用PI代替FVS（FVS说明书说用DMSO溶解后只能用90天，成本还蛮高的），流程也是一样的么？
另外我做的是THP-1用PMA刺激成的巨噬细胞，用EDTA消化下来的，PMA和EDTA是否会激活STAT6的磷酸化呢？第一次做阳性细胞达到了80%，老师说太高了，不过我没排出死细胞。。。

niwanmao

wdh1993 发表于 2018-6-29 10:00
谢谢老师解答。
还想请问如果想用PI代替FVS（FVS说明书说用DMSO溶解后只能用90天，成本还蛮高的），流程 ...

因为你这个实验涉及到胞内，需要固定破膜，所以PI不能用。PI只能用在表面标记的实验中，并且在上机前标记1～2分钟。

PMA是活化细胞的，很有可能会影响，建议找一下相关文献看看

wdh1993

niwanmao 发表于 2018-6-29 14:58
因为你这个实验涉及到胞内，需要固定破膜，所以PI不能用。PI只能用在表面标记的实验中，并且在上机前标记 ...

好的 谢谢老师耐心解答

wdh1993

niwanmao 发表于 2018-6-29 14:58
因为你这个实验涉及到胞内，需要固定破膜，所以PI不能用。PI只能用在表面标记的实验中，并且在上机前标记 ...

如果只做表面染色的话，不用破膜的，可以直接染FVS检测吧。

niwanmao

wdh1993 发表于 2018-6-29 17:42
如果只做表面染色的话，不用破膜的，可以直接染FVS检测吧。

你的意思应该是只做表面染色，是否可以用PI吧？
只做表面染色，FVS和PI均可用。

wdh1993

niwanmao 发表于 2018-6-29 20:17
你的意思应该是只做表面染色，是否可以用PI吧？
只做表面染色，FVS和PI均可用。 ...

好的，谢谢了！

wdh1993

niwanmao 发表于 2018-6-29 20:17
你的意思应该是只做表面染色，是否可以用PI吧？
只做表面染色，FVS和PI均可用。 ...

老师，在这里还想请教一个问题。。。。贴壁细胞做磷酸化的时候用胰酶或者EDTA消化呢？两者对实验结果是否有影响？

niwanmao

wdh1993 发表于 2018-7-15 21:48
老师，在这里还想请教一个问题。。。。贴壁细胞做磷酸化的时候用胰酶或者EDTA消化呢？两者对实验结果是否 ...

这应该问题不太大。