CFSE染色后如何用流式分析T细胞增殖

405892272 · 发表于 2018-7-3 15:12:43

我是流式新手，最近在做T细胞用CFSE染色后流式分析T细胞增殖情况。可是有些迷茫：第一步是分离PBMC，第二步是直接用CD3/CD28刺激呢还是先用CFSE染色呢？我的第三步是将T细胞与MSC细胞共培养。第四步是流式分析共培养后MSC细胞对T细胞增殖情况，首先不知这样的设计对否，请指点。其次不太清除具体怎样用流式检测T细胞增殖？望解答。

niwanmao · 发表于 2018-7-3 15:12:44

1、分离细胞。上机确定空白位置。
2、CFSE染色。上机，同样的电压条件，确定细胞染色情况，是否已染上。
3、CD3/CD28刺激。上机，同样的电压条件，确定刺激后增殖情况。
4、与MSC共培养。上机，确定MSC对增殖的影响。

甜鼠肉乎乎 · 发表于 2019-4-8 13:12:55

niwanmao 发表于 2018-7-3 15:12
1、分离细胞。上机确定空白位置。
2、CFSE染色。上机，同样的电压条件，确定细胞染色情况，是否已染上。
3 ...

老师我在做CFSE的时候根据师姐的PROTOCOL是这样的
1 分离脾脏混合淋巴细胞
2 CFSE染色（一组是培养基，一组是培养基+抗原肽：一种可以体外诱导心肌炎的多肽）
3 染CD4 收集细胞上机
但是上机的时候无论是第一天还是第三天都没有CD4阳性群，CFSE倒是可以分群。镜下细胞增多但不成团。请问老师是不是我没有加CD3/28包板子的原因呢？非常感谢您的浏览和解答！

liuruiluna · 发表于 2019-4-8 14:36:55

要不要加CD3、CD28应该先看一下你的实验目的，你是为了测这种多肽对淋巴细胞的促进增值作用呢？还是为了检测它对CD3、CD28活化增殖的抑制作用，这是实验设计问题

甜鼠肉乎乎 · 发表于 2019-4-8 15:19:23

liuruiluna 发表于 2019-4-8 14:36
要不要加CD3、CD28应该先看一下你的实验目的，你是为了测这种多肽对淋巴细胞的促进增值作用呢？还是为了检 ...

感谢您的回答，就是我的实验目的是想测试多肽对淋巴细胞的增殖作用，所以开始做预实验的时候没加CD3/28，但是现在细胞就是不成团，流式CD4阴性（并且已排除抗体原因，因为提取淋巴细胞直接表染CD4是分群的，用的是CD4-PECY5.5），所以不知道从哪里可以优化这个实验，能够检测到T细胞的增殖。

liuruiluna · 发表于 2019-4-8 15:26:56

我的理解是如果你测这种物质对淋巴细胞的增殖作用，应该就不加CD3/CD28，可以做一组只加CD3、CD28的作为对照组。这种多肽它的促进增值的机理是什么呢？是单独作用就能促进？还是协同了一个什么信号通路去促进增殖。如果单独加就是这样一个结果，那就只能证明这个效果吧。
再者，，第一天就CD4 没有阳性群？那刚提出细胞的时候染了CD4没有，是否有CD4阳性群

甜鼠肉乎乎 · 发表于 2019-4-8 15:39:29

是的我也觉得如果用CD3/28这样子需要做同行对照，刚提出来的是有CD4阳性的，我刚开始以为是抗体有问题，所以刚提出来以后去上机了。就是不知道还有没有其它原因会导致CD4检测不出，难道CFSE也会让CD4内吞吗？不知道怎么解释和改良这个实验

liuruiluna · 发表于 2019-4-8 18:25:34

本帖最后由 liuruiluna 于 2019-4-8 18:29 编辑

有没有一种可能，荧光淬灭了，但是CD4抗体仍然占位在位点上呢？一天后可以用CD3测一下看看。另外建议要染死活染料排除死细胞。细胞不成团是不是可以看看优化CFSE的用量，因为CFSE对细胞有毒性，需要摸CFSE的最佳用量

13752766846 · 发表于 2019-5-5 23:04:49

淋巴细胞刺激活化后CD4会内吞之类的，所以一般用CD8_CD3+来标记

行棋无悔 · 发表于 2019-8-7 21:06:36

liuruiluna 发表于 2019-4-8 18:25
有没有一种可能，荧光淬灭了，但是CD4抗体仍然占位在位点上呢？一天后可以用CD3测一下看看。另外建议要染 ...

您好，请问细胞激活后在显微镜下观察是成团的吗，我原来以为那种成团符起来的细胞是死细胞的

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