激光一直照着，为什么没有细胞通过时，流式没信号

niwanmao

除了计数细胞外，流式还可以了解细胞的物理、化学或生物特性。流式细胞术检测到细胞的主要物理特性，是利用它们衍射、反射和折射激光相干单色光的能力。

当激光形成窄且聚焦的相干光遇到细胞（所谓的事件）时，其衍射强度与“事件”的大小成比例。流式细胞仪配备有光电二极管，用于收集激光束路径中的细胞衍射产生的光，即前向散射光（FSC）。那么这个时候可能就有FLOWER问了，如果这样的话，没有细胞通过的时候，激光也应该一直照着光电二极管，应该是源源不断的产生信号才对，为什么只有细胞通过时才会有反应呢？

看下面这个图：

图中的红点就是流式细胞仪配备的遮光板，正是此物，才使得没细胞通过时，光电二极管不会收集到错误的光信号（上图a）。只有当细胞通过时，光束会根据细胞的大小不同，成比例地扩大，FSC光电二极管可以收集到与细胞大小相关的光信号（上图b）。

除了FSC检测器以外，流式细胞仪还设置了其它光电二极管或光电倍增管（PMT）收集由细胞表面以及其内部的细胞器、囊泡、颗粒等反射的光，这类光与激光前进的方向呈一定角度，所以称为侧向散射光（SSC）信号，其强度与细胞的颗粒度成比例。因此，在血液样本中，没有细胞核的红细胞将SSC非常小，而颗粒较多的的粒细胞SSC大，而如果只有液体而没有细胞通过时，就更加不会出现SSC信号了。不过不同仪器SSC收集的角度会有所不同，甚至目前有些仪器在紫光通道也设置了SSC。

至于荧光参数则更好解释，没有细胞通过，就不会存在结合的荧光素被激光照射，所以就更加不会检测到荧光信号。

最后，赠送大家一张目前最常见的一系列荧光素及其发射、激发光谱和使用的激光器：



参考文献：Anna Porwit, Marie Christine Béné. Multiparameter Flow Cytometry in the Diagnosis of Hematologic Malignancies. Cambridge University Press, Jan 25, 2018

facetodog

就是挡针？

niwanmao

facetodog 发表于 2018-7-16 12:42
就是挡针？

英文名叫obscuration bar

私学者

没有细胞时，穿过液流的光束为啥是平行的

niwanmao

私学者 发表于 2018-7-16 20:37
没有细胞时，穿过液流的光束为啥是平行的

只是一个示意图，意思就是因为没有细胞通过，所以光束没有发生散射，非常均匀的一个小光斑，刚好被遮光板挡住。

私学者

作者你好！我想请教一些问题：前向收集信号的原理还比较好理解，侧向和荧光信号的收集就很难理解了。一般都是呈一定角度的，这个角度是如何控制的呢？首先当有细胞通过是，前向就一定有信号吗？其次，激光打在液流上，形成衍射环，为啥是环状呢？然后，当用荧光染料上样时，为什么会形成一个长亮的光斑，而用微球上样，却看不到光斑呢？这些都太费解了，都查了一段时间文献了，也没有找到相关的文献，流式的光路系统到底是怎样形成的，希望你能替我解答，感激不尽！

acj

我来回答，答错了别怪。
因为没有细胞的时候没有前向散射，虽然说得是FSC，但是实际上是有角度的，大概5~10度角检测前向。直接正对激光的话，亮度太大，信好太强，估计检测器寿命成问题哦。