流式细胞学检测大鼠血液CD45 CD61 白细胞不分群 CD45表达很...

小嗳嗷

   使用大鼠心脏血 枸橼酸钠抗凝后加入CD45 及CD61抗体孵育，检测白细胞和与白细胞结合的血小板 使用RBC Lysis Buffer (10X)  稀释至1X后 全血：裂解液1:20 (Biolegend公司产品) 避光裂解红细胞10min    离心，PBS重新吹打悬浮，标本清澈透明，但流式细胞仪检测后发现FSC-SSC图中，白细胞不能明显的见到淋巴细胞-单核-粒的分群。且检测反应CD45表达很差。请问大家一下什么原因呢？   

加入CD45 CD61的测试管

一个是未加抗体的阴性管                          一个是加入了抗体的测试管

niwanmao

CD45出问题的概率非常低，除非保存不当导致抗体失效。
第一张图应该是没加CD45吧。
第二张图看着就像都是红细胞或碎片，是否裂解不完全。

小嗳嗷

niwanmao 发表于 2018-7-16 19:20
CD45出问题的概率非常低，除非保存不当导致抗体失效。
第一张图应该是没加CD45吧。
第二张图看着就像都是红 ...

第一张图是没加抗体的阴性管
第二张是实验管
抗体、试剂规格(均为Biolegend产品)
FITC-CD61 rat 0.5mg/ml
PE-CD45 rat 0.2mg/ml
RBC Lysis buffer 10X
       实验计划方案：
1.   50ul 枸橼酸钠（1:9）抗凝的大鼠心脏血标本50ul。
2.   按说明书加入了FITC-CD61  抗体1ul （≤ 1.0 μg per 10 cells in 100 μl volume）PE-CD45 抗体1ul (≤0.25 μg per million cells in 100 μl volume) ，避光孵育20min。
3.   1XRBC Lysis buffer 500ul避光裂解5min。
4.   300rcf, 5min离心后弃上清，加入500ul PBS洗涤，再次离心弃上清液。
5.   加入500ul 含1%多聚甲醛的PBS使细胞悬浮后上机检测。
问题：
1.白细胞分群不好（听说大鼠的白细胞分群本来就不明显）
2.CD45表达的细胞太少了

请问标本处理的过程有什么问题需要改进吗？

niwanmao

小嗳嗷 发表于 2018-7-17 12:29
第一张图是没加抗体的阴性管
第二张是实验管
抗体、试剂规格(均为Biolegend产品)

你如果要测血小板，那么需要对样本进行稀释，不能用这么大量。
裂解液太少，一般2ml

小嗳嗷

niwanmao 发表于 2018-7-17 13:21
你如果要测血小板，那么需要对样本进行稀释，不能用这么大量。
裂解液太少，一般2ml
...

老师 我要检测的是白细胞-血小板聚集体的指标 CD45标记白细胞 CD61标记血小板 检测双阳性表达 如果50ul全血过多，那稀释多少倍合适呢，稀释后的抗体用量该怎么调整呢 我现在是参照全血体积加的抗体。
另外RBC lysis buffer这个产品的说明书建议100ul全血用2ml裂解液，是1：20的方案。很多人说大鼠的细胞更容易裂解，所及我减少了裂解液的用量，用了1：10的方案。

niwanmao

小嗳嗷 发表于 2018-7-17 13:43
老师 我要检测的是白细胞-血小板聚集体的指标 CD45标记白细胞 CD61标记血小板 检测双阳性表达 如果50ul全 ...

血小板和白细胞聚集体的Protocol，参考一下http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-64-1-1.html，虽然这个Protocol是人的，但是通用。

小嗳嗷

niwanmao 发表于 2018-7-17 14:05
血小板和白细胞聚集体的Protocol，参考一下http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-64-1-1.html，虽然这个Pro ...

老师 这个文献我也看过。。。标本制作的大体思路就是1.全血及抗体混合孵育 2.红细胞裂解 3.缓冲液重悬后上机。我也是根据这个思路做的，但是我做的是大鼠血。我也查阅了很多文献，人血的检测根据这个思路都能出不错的结果，而且人血抗体产品也标注了20ul per text这个用量 。但是鼠的全血及抗体比例就很难掌握，说明书推荐的剂量是10^6/100ul这个体系来计算的 给抗体使用剂量造成了麻烦。还有裂解液的用量和裂解时间 都不太好掌握，有的人认为裂解2次效果更好，但我又担心裂解2次会对血小板造成影响。所以整个实验有些陷入僵局了。

niwanmao

小嗳嗷 发表于 2018-7-17 16:25
老师 这个文献我也看过。。。标本制作的大体思路就是1.全血及抗体混合孵育 2.红细胞裂解 3.缓冲液重悬后 ...

抗体即使量不够，也不可能出现染不上的情况，从图上看，更可能是没裂解干净。
裂解液的质量很重要。你可以试试我们出的这个溶血素，在小鼠样本上裂解效果挺好。

小嗳嗷

niwanmao 发表于 2018-7-17 18:15
抗体即使量不够，也不可能出现染不上的情况，从图上看，更可能是没裂解干净。
裂解液的质量很重要。你可 ...

检测流式人员反映CD45是有阳性表达的，但表达量很少，感觉结果不理想。说是可能与抗体用量或者细节操作有关。红细胞裂解不完全也会影响CD45表达么？

niwanmao

小嗳嗷 发表于 2018-7-17 19:52
检测流式人员反映CD45是有阳性表达的，但表达量很少，感觉结果不理想。说是可能与抗体用量或者细节操作有 ...

裂解不完全不是影响CD45表达，而是因为CD45阴性的红细胞过量，使得CD45＋的白细胞信号被覆盖。
例如我裂解完全，取1000个细胞，有900个是白细胞，那么就很清楚看到CD45＋信号。而如果裂解不好，取1000个细胞，有990个就可能是红细胞，只有10个是白细胞，混杂在1000个信号里面，估计谁都看不清楚。