间接单染实验小问题

阿依依啊

刚刚接触流式。。我的处理如下：
用胰酶替代物（Cellstripper）消化细胞，培养基终止消化，吹下细胞。1200rpm离心5分钟。
冷的PBS（含1%NaN3）洗涤2次。
用3%FBS/PBS室温封闭1小时。
冷的PBS（含1%NaN3）洗涤2次。
加入一抗，4度孵育1小时。
冷的PBS（含1%NaN3）洗涤2次。
用1：500的FITC标记的二抗孵育。
冷的PBS（含1%NaN3）洗涤2次。
上机。
发现原本每组应有的1*10^6 个细胞最后只能检测到一两千个。。洗涤步骤的离心转速都加到3000rpm，时间也有10分钟了，细胞还是丢掉很多。。
请问有什么方式可以改进？
另外，我的背景很深，封闭液换成抗二抗的IgG也没见好转。。怎么减小非特异性结合？

otoizz

水平转子，500g- 800g 5 分钟，应该细胞得率还可以。洗细胞的体积多大？
NaN3的目的是什么？浓度不低。
背景是怎么检测的？流式一般比较实验管和二抗对照的差异。

niwanmao

1、洗涤次数过多，建议收集细胞后，用含1~2%FBS的PBS洗涤一次之后，室温孵育10分钟即可。一抗和二抗孵育后，都洗涤一次即可。
2、转速用500g离心5分钟即可，不会离不下去的，这个高转速，反而会使细胞碎掉。

阿依依啊

otoizz 发表于 2018-7-17 09:43
水平转子，500g- 800g 5 分钟，应该细胞得率还可以。洗细胞的体积多大？
NaN3的目的是什么？浓度不低。
背 ...

角转子，1mlPBS洗的。NaN3是参考abcam上的protocol的，说是可以有效防止膜上的抗原内化。。也不知道是不是真的有效。
所指的背景就是单独二抗组。它的MFI和实验管没有很大差异

阿依依啊

niwanmao 发表于 2018-7-17 10:20
1、洗涤次数过多，建议收集细胞后，用含1~2%FBS的PBS洗涤一次之后，室温孵育10分钟即可。一抗和二抗孵育后 ...

谢谢倪老师的建议。我再试试这个条件。

otoizz

阿依依啊 发表于 2018-7-17 20:15
谢谢倪老师的建议。我再试试这个条件。

一般离ep管的角转子的话，得3000-3500转 5分钟。最好用水平转子。如果是二抗和实验管没区别，可能抗原表达或者一抗的结合能力本身比较弱。其他方法确定该抗原表达了？可以在加个空白对照，什么都不加的。