求助大神：细胞周期分析

watch_77

使用碧云天的细胞周期和凋亡检测试剂盒，按照说明书处理细胞，细胞量约5*10⁶，加入染液后约2个小时上机，发现有红色沉淀，很难吹散，过滤后上机，老师说细胞量比较少，然后做出来的图CV值很大，G0/G1期特别宽，然后S期和G2期区分不明显，尤其看不到G2期的峰，请大神指教，到底哪里出了问题？

niwanmao

先提醒一下，以后发帖请在http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?gid=37处选择相应的子版提问，本次手动帮你转移了。为了网站，谢谢配合。

从结果看，有染上去，但是从你描述和结果图形看，粘连严重，我不知道你具体的操作步骤是什么样的，例如乙醇固定的时候，操作是否有边振荡边滴。

watch_77

具体操作步骤：
1，胰酶消化细胞，PBS洗2遍，残留50ul PBS吹匀沉淀
2，加入1ml 预冷的70%乙醇（PBS配制），边加边吹打混匀，-20℃固定48h
3, 取出固定后的细胞，吹打混匀后过一遍细胞筛
4，将滤过液1500rpm离心4min，细胞沉淀用PBS洗2遍
5，加入500ul 染色缓冲液，25ul PI（20╳）, 10ul RNase A（50╳），吹匀后37℃避光孵育30min, 随后放入4℃，约2小时左右上机
请老师看看有什么问题吗？

niwanmao

watch_77 发表于 2018-8-7 10:48
具体操作步骤：
1，胰酶消化细胞，PBS洗2遍，残留50ul PBS吹匀沉淀
2，加入1ml 预冷的70%乙醇（PBS配制）， ...

如果确认操作无误，问题不是很大。
你下次试试37度孵育和室温孵育，同样30分钟，马上上机检测，期间每隔10分钟振荡一下。