求助

duanyt · 发表于 2010-10-12 15:47:04

本帖最后由 duanyt 于 2010-10-12 16:03 编辑

老师你好，我昨天做了一批流式（第一次做），大概步骤是：1、准备好细胞后，先用1%的BSA孵育30min；2、离心去除BSA液后加入直标PE-A及间标一抗B，孵育20min；3、冰PBS洗一遍，加入间标二抗，孵育20min；4、洗一遍后1mlPBS重悬，一小时后上机检测。两次孵育均在4℃、避光。结果所有细胞均标记失败，直标、间标均没有荧光结果。请问老师这种情况最可能是哪块出问题了？谢谢解答！

niwanmao · 发表于 2010-10-12 19:01:59

老师你好，我昨天做了一批流式（第一次做），大概步骤是：1、准备好细胞后，先用1%的BSA孵育30min；2、离心 ...
duanyt 发表于 2010-10-12 15:47

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能不能把图放上来看看？
从步骤上来看应该没有什么问题。最主要得确定一下抗体是否有问题。另外，孵育其实不一定要4℃，只要避光即可。

duanyt · 发表于 2010-10-14 00:04:30

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2010-10-14 00:04 上传
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这是结果，第一个是空白对照（没加抗体），第二个是正常对照组（没加药），第三个是加药组。

niwanmao · 发表于 2010-10-14 13:48:02

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这是结果，第一个是空白对照（没加抗体），第二个是正常对照组（没加药），第三个是加药组。

...
duanyt 发表于 2010-10-14 00:04

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看了这三个图，我认为：
1、首先最好用表达这个标记的细胞来排除一下抗体问题。
2、如果抗体确实没问题，我建议你把直标和间标分开来做再试试。

stef1981 · 发表于 2010-10-15 10:48:05

你的图有两个问题
首先，gate没有设，在FSC-SSC中应该排除细胞碎片
其次，FITC阳性是有的，只是荧光补偿没调好。
从图中可以看出，你的加药组跟未加药组细胞凋亡差异不大，应该加大药的剂量

niwanmao · 发表于 2010-10-15 11:38:44

你的图有两个问题
首先，gate没有设，在FSC-SSC中应该排除细胞碎片
其次，FITC阳性是有的，只是荧光补偿没 ...
stef1981 发表于 2010-10-15 10:48

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stef1981说的很不错，不过个人私下认为：像楼主这几幅图gate设不设相差不大，而且FITC这样的微弱阳性我认为更象是非特异性荧光。

duanyt · 发表于 2010-10-15 11:48:04

谢谢两位老师解答，我准备这两天再做一次，看看结果如何。

stef1981 · 发表于 2010-10-15 17:34:34

stef1981说的很不错，不过个人私下认为：像楼主这几幅图gate设不设相差不大，而且FITC这样的微弱阳性我认 ...
niwanmao 发表于 2010-10-15 11:38

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还是不一样。第一幅图有两个细胞群，上面那群就是细胞碎片。第一幅右侧几乎没有弱阳性，第二三幅还是有1%左右。也有可能是抗体失效了

duanyt · 发表于 2010-10-18 12:00:29

重新做了一批，将BSA孵育半小时省略，只用0.1%BSA的PBS做洗液，然后室温孵育，其余步骤不变，标记结果见图：第一幅图是没加抗体的对照组，后面几幅是实验组，最后一图是直标间标混合标记。这些图上能否看出还有什么不合理需要改进的地方？谢谢

20101017.pdf (424.92 KB, 下载次数: 6)

niwanmao · 发表于 2010-10-18 14:13:06

重新做了一批，将BSA孵育半小时省略，只用0.1%BSA的PBS做洗液，然后室温孵育，其余步骤不变，标记结果见图 ...
duanyt 发表于 2010-10-18 12:00

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分析还是要设门，前面几幅图不设门无所谓，最后一幅碎片多，就必须要设门，否则都不知道阳性那一群到底是碎片还是细胞的。

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