流式补偿方法的最佳实践

niwanmao

为什么会有补偿
每种荧光素有其最大发射波长，就是说它在那个波长的光子数量是最多的，但是在相邻的若干纳米范围内，还是有其它波长的光子，只不过相对较少，这些不同波长的光子汇总成一个呈近乎正态分布的图形，如下图所示，FITC荧光素尽管在524nm的光子数量最多，但在585nm以上，仍有相当数量的光子，这些光子就容易跑错门，跑到585nm通道，形成一定的信号：


调不调补偿，有什么差别？

如果你只是单标一个FITC，那么这些光子跑错了门就算了，不调节补偿，对我们要检测的信号，没有任何影响，反正它们漏过去的那通道我们不需要分析。 但如果是多个荧光素，并且发射光谱之间有重叠就不能就这么算了，看一下图像，没调补偿是这样子的：


调好补偿是这样子的：


怎么调补偿？
在初期，曾有人说不用调补偿，而是通过如下设门，对各荧光单阳性和双阳性区域进行设门：


后来，改为手工调补偿，将单阳性群体的阴性指标MFI调节到和阴性群的阴性指标MFI一致，如下图是Calibur上面的补偿调节，应该很熟悉吧：


那么究竟调到多少算到位呢？看下图，你可以分别记录下补偿值0％、20％、25％、30％时对应的阳性细胞群、阴性细胞群的阴性指标MFI：


接着，对这些指标，在Excel或其它统计学软件上绘图，拟合出线性方程，两条直线交叉的位置，就是最佳的补偿值（对于上面这例，最佳补偿值大约在24.445％）：


但这两个方法在双色，还可以用用，一旦到3色以上，互相之间并非单因素影响，就不能如此简单计算了。就需要用到目前大多仪器配套软件都具备的自动补偿功能了。用各荧光素抗体进行单染（需要细胞对各个抗体均能分出阳性群和阴性群，如果某抗体没有明显分群，可采用相同荧光素其它抗体代替），获取完之后，自动补偿的计算方式是对每一种可能产生的干扰荧光素，列出一个矩阵：


看到这个公式是否已经晕了？幸好我们自己不需要手工计算，各软件都有自动补偿程序，可以帮我们计算好。

现在有自动补偿微球，其原理就是微球可以结合各种抗体，结合未染的微球，就可以形成明显的阳性群体和阴性群体，所以很容易做自动补偿，不过在实践中，我们可以发现由于微球的很多特性和细胞不一样，所以导致最后产生的补偿值与细胞相差较大。因此，如果有可能，尽量用细胞。


看完这么多，你应该大致懂了原理吧，更多实战方面的技巧和资料，可访问论坛搜索『补偿』，以下是部分资料链接：
天，为什么我的补偿调不好（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6163-1-1.html）
从一幅图看补偿是否调整到位（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2890-1-1.html）

信源：ExpertCytometry，https://expertcytometry.com/best ... tion-methodologies/