流式可在2小时内明确细菌性腹膜炎，别的方法做的到吗？

niwanmao

如果不进行有效的抗菌治疗，腹膜透析（PD）相关的腹膜炎会迅速危及生命。然而，常规基于培养的微生物学检测很少能快速为临床医生提供指导，从而导致临床上通常采取广谱经验治疗。此外，在一些中心，培养阴性腹膜炎的发生率接近20％，故需要新的方法能够指导临床医生治疗，改善患者的预后。

现在，通常采用不依赖于培养的微生物技术来诊断感染，但PCR等方法在PD流出物的检测上表现不佳，可能是由于存在抑制剂（如纤维蛋白）并导致脱氧核糖核酸降解。

流式可以很好的弥补培养和PCR的缺陷。澳大利亚的Mulroney KT在2018年最新一期Perit Dial Int. 杂志上分享了一个案例，在样品接收后2小时内检测并计数了腹水中存在的细菌、白细胞和其他临床相关颗粒，确定流式细胞术在常规培养依赖性测试技术无法提供任何信息的情况下诊断PD相关的细菌性腹膜炎。

方法
将腹水无菌环境下倒入2个50-mL Falcon离心管中。 将样品依次以200×g、400×g和9,000×g离心以除去肉眼可见的纤维蛋白沉积物、分离出人细胞、分离出细菌细胞。 将细胞团块重新悬浮于预热（37℃）培养基中（Dulbecco's Modified Eagle's Medium [DMEM]用于人细胞，Mueller-Hinton Broth [MHB]用于细菌）。 两种溶液都添加了20％v / v胎牛血清（FCS）以稳定细胞。

用0.1μm过滤的Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤人细胞悬浮液，与小鼠抗人CD45 APC-H7一起孵育30分钟，洗涤，用10μM SYTO9染色10分钟，上机检测和分析。

用过滤的HBSS洗涤细菌细胞悬浮液，用10μM SYTO9和2μL/ mL Fixable Live / DEAD NearIR（FNIR）染色30分钟，然后上机检测分析。

结果
事先使用金黄色葡萄球菌ATCC 29213和大肠杆菌ATCC 259221的对照培养物进行设门质控，设置好非细菌、细菌、人白细胞三个门。接着进行实际样本的分析。



↑ 图1，用FSC-Log/SSC-Log分析，白细胞在最右上方区域，而细菌在碎片区域，继续在CD45/SYTO9散点图上显示，可见CD45＋SYTO9＋＋的白细胞和CD45－SYTO9＋的细菌能区分开，第三个直方图显示了白细胞和细菌CD45的差异。



↑图2，FSC-Log/SSC-Log散点图上，排除掉白细胞之后，剩余的信号显示在SYTO9/FNIR散点图上，双阳性区域就是细菌。



↑最后，通过电镜证实，腹水中存在的是既往发生过的革兰氏阳性巨大芽孢杆菌感染。



通过这个流式检测方法，可以在2小时内完成检测。因此这个检测方法对于一些无菌体液是否存在细菌性感染，是很有帮助的，关键是快速简单。当然，目前这个还只是个例报道，应用到临床，还需要更多病例验证，并且需要将流程和硬件做得更标准化，还需要考虑真菌和腹膜透析液的影响。


文献源：Mulroney, K. T., Hall, J. M., McGuire, A. L., Inglis, T. J. J., & Chakera, A. (2018). Case Study: Applying Rapid Flow Cytometry Analysis to CAPD Effluent. Peritoneal Dialysis International, 38(5), 376–379. doi:10.3747/pdi.2017.00231