红细胞染色protocol

我想成大牛

hi
各位老师，有没有做红细胞染色的方案啊，我在论坛里看了如何获取红细胞，但是我实验部分比较模糊，用抗体染色的时候还会出现细胞凝集成快，染色效果很差，怎么解决呢?

niwanmao

染色时为什么会细胞凝集？没加抗凝剂？

我想成大牛

niwanmao 发表于 2018-11-9 07:43
染色时为什么会细胞凝集？没加抗凝剂？

有抗凝剂，我取了5ul全血染色红细胞，但染完一抗后红细胞都聚集成小团快了。

niwanmao

我想成大牛 发表于 2018-11-13 13:06
有抗凝剂，我取了5ul全血染色红细胞，但染完一抗后红细胞都聚集成小团快了。 ...

我平时也做PNH的红细胞染色，是将10ul抗凝全血加入到1mlPBS中，然后再取100ul。

我想成大牛

niwanmao 发表于 2018-11-13 21:24
我平时也做PNH的红细胞染色，是将10ul抗凝全血加入到1mlPBS中，然后再取100ul。 ...

我做的是CD235a，昨天看了一些文献，他们是0.5ul血加入到50ul PBS里面，1500rpm 5min这样的洗涤条件。我试了一下，先按照条件将0.5ul的血分别加入到50ul的PBS和MACS里面，然后将0.5ug的间标抗体分别加进去，混匀后静置。结果15min后还是会出现聚集，移液器吹打都散不开，PBS和MACS没有明显的区别。

niwanmao

我想成大牛 发表于 2018-11-15 09:26
我做的是CD235a，昨天看了一些文献，他们是0.5ul血加入到50ul PBS里面，1500rpm 5min这样的洗涤条件。我 ...

MACS不是磁珠分选吗？
有没有试过我前面说的方法，我们做PNH也是用CD235a标记红细胞的

我想成大牛

niwanmao 发表于 2018-11-16 08:23
MACS不是磁珠分选吗？
有没有试过我前面说的方法，我们做PNH也是用CD235a标记红细胞的 ...

MACS是PBS+1%FBS+0.25mM EDTA。我按照老师的方法做了，我设了2组，一组同型对照，一组实验抗体，做了之后发现IgG1没有聚集沉淀，实验抗体聚集沉淀了。就是染色15min后，1500rpm离心之后，实验抗体的细胞聚集成小团快，并且枪吹不散。我还不清楚原因，可能需要查找一下影响因素。

niwanmao

我想成大牛 发表于 2018-11-21 08:44
MACS是PBS+1%FBS+0.25mM EDTA。我按照老师的方法做了，我设了2组，一组同型对照，一组实验抗体，做了之后 ...

这有点奇怪的，我从来没见过这种事情，你用的CD235a是哪里的？克隆号是什么？什么荧光素标记？

我想成大牛

niwanmao 发表于 2018-11-22 08:49
这有点奇怪的，我从来没见过这种事情，你用的CD235a是哪里的？克隆号是什么？什么荧光素标记？ ...

CD235a有两个，一个时我们自己表达的，一个是BD的purified，克隆应该是GA-R2，两个的实验现象是一样的，都会聚沉红细胞。聚沉后我继续正常做，结果上机什么细胞都没有获取到。Mouse IgG1同型对照的现象是正常的，上机能获取到红细胞。

niwanmao

我想成大牛 发表于 2018-11-22 17:20
CD235a有两个，一个时我们自己表达的，一个是BD的purified，克隆应该是GA-R2，两个的实验现象是一样的，都 ...

你的意思是这两个抗体都是没有荧光素的，那么实验用的是间标方法？实验温度是4度还是室温？