多色标本的荧光问题

W3YC

倪老师
我目前在做血小板的流式
检测血小板激活状态
之前选用了CD41a标记画门血小板
选用P-selection（APC），CD63（PE）， anti-fibriogen（percp）作为血小板激活的Marks

SSQ N和SSQ A在做的时候因为FBG抗体没有到货，就用了CD63和62，结果发现即使不标记FBG，在患者阳性官里的percp通道仍会有表达
如图SSQ N 和 SSQ  A
后来抗体到货，在同型对照选择CD41a圈门血小板，在用I给G1做同型画门（我也是上了流式中文网才知道现在都有F但是同型都买了故且做了）
结果发现，即使不标记FBG这个mark，在percp通道仍会有表达增多
如图SSQ-N.SSQ-A
是否因为APC的荧光溢漏呢？
后来我就把FBG单独做了一管，发现FBG表达就很低了，这是为什么呢？
我想是否是因为APC渗漏导致之前多色试验出现了这样的bug，今天请教一个师兄，师兄说是因为抗体的原因
如图GRT-9（CD41a+空白对照）GRT-10（CD41a+FBG）

W3YC

这两张图是我开始做实验的时候
SSQ N是同型对照管（CD41a+IgG1（APC）+IgG1（PE）
SSQ A是激活管（CD41a（FITC）+CD62p+CD63）
开始做的时候还不了解流式，没有用FMO做
图片如下图

percp通道是没有加入任何抗体的，为什么也会有阳性表达，是因为APC的荧光渗漏吗？今天问实验室的前辈说不是

sunny2829

如上图，PE光谱有部分溢漏到PerCP（红笔全出部分）。多色是需要进行补偿调节的。

niwanmao

W3YC 发表于 2018-11-19 21:14
这两张图是我开始做实验的时候
SSQ N是同型对照管（CD41a+IgG1（APC）+IgG1（PE）
SSQ A是激活管（CD41a（F ...

我对这个设门有点疑问，这个圈的位置，接近淋巴细胞，血小板肯定比淋巴细胞小多少倍都不知道。
至于对FBG的问题，你应该用一管CD41a、CD62P、CD63染同样的样本，做FMO 对照，用FMO的门来圈。

W3YC

niwanmao 发表于 2018-11-20 20:01
我对这个设门有点疑问，这个圈的位置，接近淋巴细胞，血小板肯定比淋巴细胞小多少倍都不知道。
至于对FBG ...

是这样的倪老师在左下角设门以后再用CD41a画出血小板的
淋巴细胞是不会表达CD41a的
从而筛选出来血小板

另一个问题，倪老师
我看了您发的很多Fmo对照的帖子
我理解的是每次画门都需要做FMO，那这样抗体用的很快啊

niwanmao

W3YC 发表于 2018-11-21 17:29
是这样的倪老师在左下角设门以后再用CD41a画出血小板的
淋巴细胞是不会表达CD41a的
从而筛选出来血小板

我知道你是用CD41a圈的，但这个FSC如此之大，是否可能是血小板粘附在淋巴细胞或单核细胞上？

做FMO，尽量一批样本可以多一些，节省用量。如果还是觉得浪费，而且仪器状态稳定，可以隔几批做一次。

W3YC

niwanmao 发表于 2018-11-22 09:03
我知道你是用CD41a圈的，但这个FSC如此之大，是否可能是血小板粘附在淋巴细胞或单核细胞上？

做FMO，尽 ...

明白了，谢谢倪老师
因为所读的参考文献都是不洗标本，我之前也也有过这样的疑问现在明白了
另外一个问题倪老师
流式电压的问题
比如我调节PE通道的电压，为什么调大反而压线，调小反而不压线呢？
流式小白自己摸索总是很多弯路，论坛帮助了我很多

W3YC

sunny2829 发表于 2018-11-20 11:09
如上图，PE光谱有部分溢漏到PerCP（红笔全出部分）。多色是需要进行补偿调节的。
...

嗯，谢谢前辈指点
无奈实验室是Beckman，调补偿太随意了
问实验室师兄怎么样调，师兄说横平竖直就好了
这样下来主观性太强了
而且所有数据用同一个补偿以后的图很不好看