关于自动补偿和不同软件的补偿适配问题

毛豆24821

各位老师好，接触了流式1年多，慢慢遇到很多问题，欢迎大家多多指教和讨论。今天问一些关于补偿的问题。

1：经过UltraComp eBead Compensation Beads (Thermo Fisher 01-2222-42)的自动补偿后，sample如果为肿瘤的话，补偿会还需要一定的再调才能合适，但是外周血或者脾脏就会比较合适或者仅需要微调。
      请教有什么方法可以让自动补偿直接就合适样本，尤其是肿瘤样本？
      另外我们已经尝试过直接用样本的细胞来当自动补偿的beads去做自动补偿，还是不太合适，况且实际情况里也不会有足够的样本细胞来做自动补偿，所以这个方法不合适。在自动补偿的方法里有什么注意点，请各位指教。


2：我们流式上机的软件是BD Diva，上机结束会直接拷出来用Flowjo调节补偿，最近我们尝试在Flowjo调节完补偿后，将补偿的数值统一到Diva里，再将文件导出，但是我们再在Flowjo里查看文件时，发现虽然补偿的数值是一样的，但是图形又不合适了，还是需要再调补偿。
     请教上述情况是为什么？
     我们是想得到Diva导出的原文件直接Flowjo打开就是合适的补偿状态，是不是还是需要在Diva中调节好补偿之后，这样导出的数据再去Flowjo打开才比较合适？


烦请赐教！非常感激！

niwanmao

1、补偿微球设出的补偿，不适合细胞样本，因为两者的颗粒度不一样。要想让补偿能够直接适合样本，必须得样本每个标记都能做出单阳性。
2、不同软件，补偿的算法会有所不同，因此补偿矩阵不通用。

毛豆24821

niwanmao 发表于 2018-12-3 15:13
1、补偿微球设出的补偿，不适合细胞样本，因为两者的颗粒度不一样。要想让补偿能够直接适合样本，必须得样 ...

1：如果需要样本每个通道都能做出单阳性的话，可不可以尝试，购买CD4的每个通道，然后用脾脏（因为细胞数目较多，可行）代替beads染panel涉及到的通道，去做自动补偿，当中电压用实际样本来确定。

2：那天是软件有些小问题，所以Diva和Flowjo数据补偿不合适。谢谢。

PS：请问老师有遇到过Diva里FSC和SSC的W、H变得很诡异，整个软件里的数据去黏粘细胞这一块的图形都变了，不知道有没有这方面的经验过，求指教！多谢。

niwanmao

毛豆24821 发表于 2018-12-4 16:58
1：如果需要样本每个通道都能做出单阳性的话，可不可以尝试，购买CD4的每个通道，然后用脾脏（因为细胞数 ...

1、可以用CD3或CD4高表达的标记去做，串联染料会有所差异，但FITC、PE等荧光素补偿值可通用。
2、好的，合适就好：）
3、你说的FSC的H和W变的诡异，是指什么情况？

毛豆24821

niwanmao 发表于 2018-12-5 15:32
1、可以用CD3或CD4高表达的标记去做，串联染料会有所差异，但FITC、PE等荧光素补偿值可通用。
2、好的， ...

推测是软件的问题，而且会所有Diva里的数据的前向测向的W和H都出问题。

niwanmao

毛豆24821 发表于 2018-12-6 12:05
推测是软件的问题，而且会所有Diva里的数据的前向测向的W和H都出问题。

...

一般BD的机器我们用A和H

毛豆24821

niwanmao 发表于 2018-12-6 13:35
一般BD的机器我们用A和H

A和H我们也用的，但是在这个诡异的软件状态中，A和H的图也不正常了，不是对角线分布的，非常的偏左上角

niwanmao

毛豆24821 发表于 2018-12-6 13:38
A和H我们也用的，但是在这个诡异的软件状态中，A和H的图也不正常了，不是对角线分布的，非常的偏左上角 ...

如果A和H也不是线性，首先看一下Diva软件里面Area Scaling是否设置正确，如果还是纠正不了，得问一下工程师了。

毛豆24821

niwanmao 发表于 2018-12-6 14:31
如果A和H也不是线性，首先看一下Diva软件里面Area Scaling是否设置正确，如果还是纠正不了，得问一下工程 ...

后来发现是软件出了问题，Database坏了。BD的软件硬件出问题率真的好高啊。。一年内大大小小的问题都让我小成长起来了！也挺好！

需要重新在新的Database的基础上安装Diva，重新导入数据，建议将原数据以Experiment导出，这样重新导入的时候Gates等各信息都还在。

纳兰叔夜

真是好文章，学习了