为什么连续三管外周血都没有TH1亚型出现

圈儿113

是采集的哮喘病人的外周血，用FICOL提取的外周血单个核细胞。不知道为什么感觉有中性粒，提取的时候分层还是明显的。然后，配色方案是。PE/CY7=IL-4,APC CD183,bv421 IL-17a,IFN-γ Percp-CY。我没有染CD3忘记了。试验过程是先刺激，在染去死活，加表面标记，再固定，在清洗染胞内因子。最后加固定液。刺激了5个多小时，用的BD的白细胞刺激COCKTAIL. 连续做了3管 ，TH1/TH2/TH17都很低。但是传统在TH1上表达的CXCR3很高！

niwanmao

有没有用Brefeldin阻断IFN蛋白转运

圈儿113

在刺激过程加入的是BD Pharmingen™ Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug™ 2ul(但是放-80度，每次都要反复冻融，但是说明书又这么说的。。没有添加倪老师您说的这个蛋白阻断剂。我一个月前也是这种做法，有刺激出来。

圈儿113

之前做了一次刺激剂加错了，本来0.5微升，加了8微升，结果是细胞在清洗的时候丢失了一部分，然后感觉结果更好看？

niwanmao

圈儿113 发表于 2018-12-10 10:04
在刺激过程加入的是BD Pharmingen™ Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug™ 2ul(但是放-80度 ...

这个试剂盒已经包含了Brefeldin A。

-80度保存。 用之前，37度水浴快速溶解，1ml细胞培养物中加入2ul cocktail，刺激4～6小时，然后收集、洗涤细胞，开始做表面和胞内染色。

听你这个描述，似乎使用上有点乱。

我想成大牛

圈儿113 发表于 2018-12-10 10:10
之前做了一次刺激剂加错了，本来0.5微升，加了8微升，结果是细胞在清洗的时候丢失了一部分，然后感觉结果更 ...

染胞内细胞因子要做破膜吧？没有使用破膜固定剂吗？

圈儿113

我想成大牛 发表于 2018-12-17 09:38
染胞内细胞因子要做破膜吧？没有使用破膜固定剂吗？

加了CD4之后，我有加固定破膜，50min后，清洗再加的胞内抗体。

圈儿113

固定破膜用的BD的破膜固定一起的那个

qingshi

明显就是刺激剂加少了