急求！！实验分组设计及样本处理请教

yrryrr

周五做脾脏细胞及肿瘤浸润组织染色，有几下几个问题不太确定，在此请教一下：
以肿瘤细胞为例检测放疗前后肿瘤浸润组织中T细胞亚型、CD69、PD-1的表达：
A.阴性对照----正常单细胞悬液----找目的细胞群
B.单阳管----CD45 PE cy7、CD3e APC cy7、CD4 FITC、CD8a PE、CD69 APC、PD-1 PE CF594-----调节补偿
C、6色管----CD45、CD3e、CD4、CD8a、CD69、7-AAD（上机前加去死活）------确定PD-1的阴阳界线
D、7色管----CD45、CD3e、CD4、CD8a、CD69、PD-1、7-AAD(上机前加去死活）------实验样本看各个细胞分群
需要确定以下问题：
1、上机前加入7-AAD去死活，需不需要做单阳管；如果需要是要加入多聚甲醛部分固定后再染色么？
2、所有的单阳补偿管均是用细胞做的，其中CD69用PMA 刺激过夜阳性群分群明显，PD-1按照说明书中要用CD3裸抗刺激3天才有明显的阳性群，是否有其他的更快的方式推荐？
3、6色管与7色管是用的对照组的即未放疗的老鼠肿瘤浸润组织单细胞悬液来做是否可以，因为需要进行CD69和PD-1的染色，所以细胞是否需要加入PMA及CD3进行刺激后再染色？（即6色管及7色管应该用刺激后的细胞悬液还是为刺激的细胞悬液）
4、后续所有实验样本是否也需要加入PMA和CD3进行刺激后染色呢？还是新鲜取出的肿瘤单细胞悬液直接进行染色即可？
5、文献中PD-1检测需要做FMO对照，这个应该怎么做？
非常感谢大家帮忙看看帮帮我确定这些问题！！

yrryrr

@niwanmao 倪老师帮忙看看吧，谢谢啦

niwanmao

1、7-AAD上机前加入，不需要做单染，不能加多聚甲醛。
2、这些指标基本上分群都是不错的，做过一次补偿之后，后续只需微调即可。辛苦也就辛苦一次吧。
3、4、我觉得你们这个实验目的应该决定了检测是直接测才对吧，为什么要刺激呢？