聊聊最让你纠结的设门参照

niwanmao

提到设门的参照，很多人第一念头就是空白对照、同型对照。

其实，空白对照是用来初步确定电压的，而非用于设门。一定要明确这点。

至于同型对照，在流式细胞术发展史上可以说是历史悠久，它的作用主要是排除特定亚型荧光素抗体的非特异性染色背景。文章也很多，但在同型对照的选择上，抗体和同型对照的亚型匹配非常重要，如果亚型不匹配，那么结果就会出乎你的意料。例如下图中，三种不同亚型的同型对照，按照推荐用量，结果可见同型对照表达水平相差很大。

                               
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因此，同型对照目前存在以下两方面缺点：
1、每个抗体均会有不同水平的背景染色，这种背景与其结合特异性、抗体浓度、抗体聚集程度、荧光素：抗体比例等因素有关。 所以，要找到一个与抗体背景染色完全匹配的同型对照非常有难度。
2、同型对照无法反映出其它通道渗漏的荧光背景。不过这个缺陷可以通过同型对照加上其它通道的相关抗体来解决（类似于FMO+同型对照）。

综上，挑选同型对照除了要选对物种、亚型，还需要看抗体的结合特异性、浓度等等各种因素，存在很大的随机性。这也是很多FLOWER在实验中发现同型对照物种和亚型都对的，为什么总是比实验标本还强或者比空白对照还弱等诡异现象。此外，我们要知道一点，同型对照是可以用Fc阻断来替代的：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5510-1-1.html


FMO对照＝Fluorescence minus one，即荧光扣除对照，指的是多色实验时，要检测某个荧光通道的表达情况，由于荧光渗漏影响占主要，所以检测时先将该通道的抗体去掉，检测一下其它通道漏到此通道的背景荧光水平，进行正确排除，从而帮助设门。

FMO对照，会让大家有种感觉特别费抗体，例如12色流式，完整的FMO应该如下图，非常壮观：


FMO对照在下列情形下尤为重要：
1、定量极弱或分群不清的细胞群体。
2、在试剂优化时衡量荧光溢漏。
但使用FMO对照需要注意：
1、荧光完全不重叠的通道之间，不需要。
2、无法衡量背景荧光，或抗体相关的背景非常明显，则不适合再用FMO来设定分界。
因此，FMO对照并非如我们想象中那样特别费。

但是，FMO对照就是最好的设门对照了吗？也未必。
在实际检测中，很多人会发现，其实FMO和同型对照都不一定能正确反映阳性和阴性的界限。这是因为有些时候，标本的背景荧光不仅仅由抗体非特异性结合和荧光渗漏两种组成，还可能有其它我们无法预料的背景荧光。此时，或许改用标记相同抗体组合的生物学对照更好。例如做胞内细胞因子的检测时，未刺激的标本基本上不表达细胞因子，就是一个很好的生物学对照。

如下图，三种对照中，生物学对照，用相同的抗体组合标记之后，较好地反映了设门位置，而FMO对照偏低，同型对照则偏高。



聊到这里，大家应该心里都有数了吧。祝愿实验都顺利，有疑问到流式中文网论坛来交流，不要害羞：）

ml171385

在论坛上逛逛可以学到好多东西啊，感谢老师