ser473磷酸化流式细胞术

Wlmedicine

您好！最近做造血干细胞磷酸化（ser473)流式。破膜用的BD perm3(包含86%的甲醇）。ser473结果不稳定，有时染的上,有时染不上。今天破膜提高到70分钟，ser473也没有染上。做了快20次了，不知道问题出在哪里？期待您的回复。

niwanmao

你可以试试不同甲醇浓度。pAKT也有可能不适合86%甲醇：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6525-1-1.html

Wlmedicine

1.固定后蛋白也会去磷酸化，也会降解？
2.如果第1条成立的话，固定后操作时间长的话，应该信号可能就会没有？而不是取决于标记核抗体后放置的时间？

Wlmedicine

流式标记的核抗体会可逆吗？而不是因为蛋白去磷酸化，或者降解。

niwanmao

Wlmedicine 发表于 2019-1-14 17:23
流式标记的核抗体会可逆吗？而不是因为蛋白去磷酸化，或者降解。

想多了。

lionmilk

Wlmedicine 发表于 2019-1-14 17:22
1.固定后蛋白也会去磷酸化，也会降解？
2.如果第1条成立的话，固定后操作时间长的话，应该信号可能就会没有 ...

我记得我以前看到过磷酸化流式的材料，大概意思是说：磷酸化状态不会持续太长时间的，随着时间的推移，相关蛋白会逐步讲解的。
请问一下你用的是什么试剂固定呢？

Wlmedicine

4%甲醛。同一管样品我测到了磷酸化信号从有到无。

niwanmao

Wlmedicine 发表于 2019-1-16 06:36
4%甲醛。同一管样品我测到了磷酸化信号从有到无。

如果是不同时间的检测，这是蛋白的去磷酸化。如果是你标记之后放置在那里，隔段时间测一次，我个人觉得更大的可能性是荧光素的淬灭，而不是你前面说的流式标记核内抗体的可逆过程。

Wlmedicine

核标记的流式抗体和表面标记的流式抗体，也需要调节补偿？

Wlmedicine

看直方图，如果把电压调大，视觉上觉得差别会明显些。但如果需要和表面marker一起调节补偿，电压就不能调节的那么随意。所以问题，核抗原和表面抗原一起标记，它们之间需要调补偿吗？