关于Annexin和7AAD染色的一大困惑

jiajinchao15

各位老师，请教一个问题！感激不尽！
我做中性粒细胞凋亡时发现一个问题：
不管是分离外周血中性粒6h还是18h后用BD公司的Annexin V/7-AAD染料都会出现同一个管子多次检测结果不一致的情况！
具体点讲：一个样本孵育完直接上机检测，早期凋亡率50%，晚期凋亡5%，过10秒钟检测早期凋亡率55%，晚期凋亡8%，再过几分钟测可能活细胞就不到20%了
本人的protocol：
1、圆底96孔板中性粒细胞培养：4x10^4个细胞/孔（密度：4x10^5/ml）
2、6h，18h时1500rpm 5min离心细胞后加入40ul binding buffer
3、加入3.5ul Annexin V+3.5ul 7-AAD后4℃孵育15min（此步骤我没有吹打混匀，不知是否有影响）
4、不离心加入160ul binding buffer后直接上机检测
随后就会出现前面描述的同一个样本多次检测存活率越来越低的情况
个人猜想了一些原因：1、孵育时间过短，后面的不到20%的存活率才是真的结果；
2、随着不断的吸取样本，悬液中Annexin V和7AAD的浓度越来越高，出现了非特异性染色，所以一开始的结果才是真的结果
下一步想用凯基生物的试剂盒看看是否也存在这个问题

请各位提出建议！！！感激不尽！！！

niwanmao

染色时，充分混匀是很关键的一个细节。
另外，你这个试剂盒核酸染料和Annexin V不是分开染的？？这个Protocol是你自己想出来的还是按照说明书的？Annexin V是需要在Binding Buffer的辅助下染色的，7-AAD或PI是另外染的。

jiajinchao15

niwanmao 发表于 2019-1-28 08:22
染色时，充分混匀是很关键的一个细节。
另外，你这个试剂盒核酸染料和Annexin V不是分开染的？？这个Protoc ...

谢谢老师！请问充分混匀是轻轻弹匀还是用枪吹匀，吹打细胞会不会造成人为死亡？
这个protocol是看了网上其他人的protocol总结的。。另外凯基的试剂盒说明书也是加了binding buffer后直接AV和PI没有先后顺序，我是应该先AV15分钟再PI 或者7AAD5分钟吗？

niwanmao

jiajinchao15 发表于 2019-1-28 08:31
谢谢老师！请问充分混匀是轻轻弹匀还是用枪吹匀，吹打细胞会不会造成人为死亡？
这个protocol是看了网上 ...

用手指弹匀或用枪头轻轻吹打均可，担心枪头影响，可将Tip头顶部剪掉一块。

核酸染料有些情况下可以一起加，但是至少要先加Binding Buffer，而你的Protocol里面是Binding Buffer最后加，这就有问题了。

jiajinchao15

niwanmao 发表于 2019-1-28 08:34
用手指弹匀或用枪头轻轻吹打均可，担心枪头影响，可将Tip头顶部剪掉一块。

核酸染料有些情况下可以一起 ...

我第二步加了40ul的binding buffer再加染料的
对了老师，除了做凋亡染色外，我其他的表面抗原比如PE-CD11b染色会洗一次再重悬上机，反而会出现MFI在3分钟内从10000衰减到7000的情况，这是因为没混匀还是染料荧光的自然衰减呢？我是不是需要用多聚甲醛固定一下再上机

niwanmao

jiajinchao15 发表于 2019-1-28 08:38
我第二步加了40ul的binding buffer再加染料的
对了老师，除了做凋亡染色外，我其他的表面抗原比如PE-CD11 ...

你是指洗涤后CD11b荧光比不洗涤的样本荧光强度减弱？这是正常的，因为不洗涤的时候，存在较多非特异性染色。

jiajinchao15

niwanmao 发表于 2019-1-28 10:19
你是指洗涤后CD11b荧光比不洗涤的样本荧光强度减弱？这是正常的，因为不洗涤的时候，存在较多非特异性染 ...

老师不是，同一管洗涤后的样本，10分钟内重复上样（比如隔1分钟跑1500个细胞），每次都会减小。。从10000到8000到7000。。。

niwanmao

jiajinchao15 发表于 2019-1-28 10:25
老师不是，同一管洗涤后的样本，10分钟内重复上样（比如隔1分钟跑1500个细胞），每次都会减小。。从10000 ...

这么短的时间内没有理由，这得从仪器稳定性上找原因了。

jiajinchao15

niwanmao 发表于 2019-1-29 10:08
这么短的时间内没有理由，这得从仪器稳定性上找原因了。

好的，谢谢倪老师，以后多多向您请教！

suriro

biolegend 的annexin V/ 7aad试剂盒的说明书中加入100ul binding buffer 以后 annexin 和7aad是同时加的，室温孵育15min，再加入400ul binding buffer (不过我一般就加200)