绝对计数，微球法好还是体积法好？

niwanmao

以前已证明，单平台法好，那么单平台绝对计数方法中，有微球法和后来不少厂家力推的体积法，究竟哪个更好呢？
2019年2月份的英国、美国、意大利、中国等七国协作研究给了我们一个结论：两种方法无统计学差异，但是两种方法均存在一定的风险和变异概率。

下面稍微回顾一下该项研究过程：
七个国家12家参与者，每家均给予6管CD34＋绝对计数质控品和6根同批次Trucount管，3管质控品用0.5ml水重悬作为高值参照，3管用1.5ml水重悬作为低值参照。

各家单位中，用体积法绝对计数的机器有：
2台BD FACSVerse™、1台CyFlow Cube 8、2台CyFlow ML 、1台optical reference flow cytometer (PhysikalischTechnische Bundesanstalt, Germany，这家公司没听说过)、2台Attune、1台BD Accuri™。

设门方法采用ISHAGE方案，具体的设门参见我们之前的论坛帖《ISHAGE方案：我们都做对了吗？》（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2765-1-1.html）。

结果如下表和下图，低值和高值相关系数在0.93和0.99：


但是，从图中低值数据部分，可以看到3个数据明显偏移（灰色三角形点），考虑可能体积法吸入的体积过大，导致结果偏低。因此，体积法的主要风险是流式细胞仪中执行定量吸入器具的准确性，因此，需要参考移液器等计量工具一样，能够有标准化的定期校准规范。
至于微球法，存在的风险主要有：
（1）微球未混合均匀，或获取低值样本时时间长导致局部微球浓度变化，这可以通过Time参数图看微球和细胞的比例变化了解；
（2）微球吸附在管壁上导致丢失，这可以通过加入0.5～1％白蛋白防止。
（3）操作员阈值设置错误，导致微球丢失。

总体来说，两种方法一致性好，但需要规范和标准。

参考文献：Saraiva L, Wang L, Kammel M, et al. Comparison of Volumetric and Bead-Based Counting of CD34 Cells by Single-Platform Flow Cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 2019 Feb 20. doi: 10.1002/cyto.b.21773.