关于细胞周期中M期阻滞细胞的筛选--流式上机前的染色问题

lyuany

最近课题做了一个小分子化合物，基本可以使悬浮的肿瘤细胞抑制在G2/M期，于是我想再进一步检测一下细胞是具体抑制在G2期还是M期的。查阅了文献以后，查到一篇文章：Loss of KLF14 triggers centrosome amplification and tumorigenesis Fan, G.; Sun, L.; Shan, P. (...)  Nature Communications, 2015, 6(1) ，里面可以用光辉霉素染M期细胞的，具体图是这样的，上面的染色步骤是这样的For analysis with mithramycin staining, an aliquot of 26106 cells was incubated with 2 ml of 0.1% nonidet P-40 in PBS for 5 min, followed by fixation with the addition of 0.7 ml of 4% formaldehyde in PBS and gentle shaking of the cells at 4℃ for 15 min. DNA was stained with 20 mg/ml mithramycin A。可以我按照上面操作以后，发现，细胞只要一加入0.1%的NP40中，就成团，变得很黏，不管怎么弹都没用~~~~~~而且是一加进去就成这样，后面试了各种方法，包括将NP40浓度降到0.01%，减少破膜时间等等，都不行，崩溃，求高人指点。

lyuany

群里可有做过M期细胞阻滞的大神吗？或者是其他的染色固定的方法？求推荐求推荐，不要沉啊~~~

niwanmao

NP40我们以前用于提取蛋白的，这个实验的目的是想把细胞破掉，提出细胞核，染Mithramycin。

看来是存在困难，而且mithramycin这个方法时间比较久了。
我觉得简单点的话，可以用7-AAD和anti-Ki67双染（参见http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2809-1-1.html）