流式新手，抗体染不上。

mandy

实验目的：检测一种病毒蛋白对人外周血PBMC中CD4+ T细胞产生的IFNγ的影响。
将野生型病毒和缺失某种蛋白的病毒感染成纤维细胞（贴壁的），感染24h后，将PBMC加进去共培养，然后加CD3/CD28刺激，最后6h加Golgi plug。收上清离心获得细胞之后就染抗体。但是没有阳性群是为什么。做了两次都是这样，流失新手，实验室也没人做过流式。

（为了验证试剂和仪器，已经通过把新鲜分离的PBMC直接染色上机，可以染上）

niwanmao

FL1＝CD4？
FL3＝IFNg？

有没有加其它抗体？

mandy

niwanmao 发表于 2019-3-22 08:57
FL1＝CD4？
FL3＝IFNg？

FLI=FITC-CD3
FL3=PerCP-CD4
还有一个抗体PE-IFN-γ，FL2

niwanmao

mandy 发表于 2019-3-22 09:26
FLI=FITC-CD3
FL3=PerCP-CD4
还有一个抗体PE-IFN-γ，FL2

1、直接分离的PBMC染CD4就存在问题，没分群。
2、刺激之后，由于你用了CD3和CD28，所以染色用的CD3 FITC结合位点要避开刺激用的CD3

mandy

niwanmao 发表于 2019-3-22 09:41
1、直接分离的PBMC染CD4就存在问题，没分群。
2、刺激之后，由于你用了CD3和CD28，所以染色用的CD3 FITC ...

1.那是CD4抗体有问题吗？我以为双阳那里有就是检测到了CD4；
2.我选刺激用的CD3抗体的克隆号是UCHT1；流式抗体的FITC-CD3的克隆号是HIT3a；

niwanmao

mandy 发表于 2019-3-22 09:47
1.那是CD4抗体有问题吗？我以为双阳那里有就是检测到了CD4；
2.我选刺激用的CD3抗体的克隆号是UCHT1；流 ...

CD4的用量需要通过滴定优化一下先。
实验组那几管的FSC/SSC散点图，与未刺激的PBMC FSC/SSC对比一下。

bear_honey

我觉着CD4还是染出来了，只不过跟阴性挨的太近了，像倪老师说的优化下cd4用量，fl3的电压可能也需要优化下。。个人感觉CD3和CD4的抗体有问题的概率不大。。。

mandy

niwanmao 发表于 2019-3-22 12:20
CD4的用量需要通过滴定优化一下先。
实验组那几管的FSC/SSC散点图，与未刺激的PBMC FSC/SSC对比一下。 ...

倪老师，这几个图就是实验组的几管以及分离后未刺激PBMC的FSC/SSC图

mandy

bear_honey 发表于 2019-3-22 14:44
我觉着CD4还是染出来了，只不过跟阴性挨的太近了，像倪老师说的优化下cd4用量，fl3的电压可能也需要优化下 ...

1.CD4的用量的话，我用的是BD的，用量按照说明书说的，1×106个细胞，100μL的体系加20μL的流式抗体。优化的话是我用几管细胞，分别染不同量的CD4抗体看看哪个染出来效果好是吗？
2.我用的仪器是Accuri C6，调不了电压。
谢谢赐教~~

niwanmao

mandy 发表于 2019-3-22 16:13
倪老师，这几个图就是实验组的几管以及分离后未刺激PBMC的FSC/SSC图

从FSC和SSC看，细胞本身的问题不大。

未刺激的样本，厂家推荐的量对大多数样本没问题，但个别种类样本可能需要找到最佳用量，至少在目前的条件下CD4的分群不行。
至于病毒转染过之后染不上，我的建议是否可以再换一个克隆号CD3？或者改用CD5或CD7来设门？虽然特异性略差点。