流式胞内染色问题--后续

jiaojiaoliu

倪老师：
      您好！我上次在这里询问了流式胞内染色问题。后来和eBioscience公司的技术支持人员联系过，他们认为是刺激的问题。我换了新了PMA和离子霉素。再做的结果还是不太对。收集病人的外周血做的结果，CD4+IL17+也只有0.2-0.4%。我觉得我的操作步骤也没什么问题。大概步骤是：
提取外周血PBMC，PBS洗涤，离心，弃上清，洗两遍，加入刺激液300ul，混匀后加入24孔板，细胞培养箱中刺激4小时。、
1ml刺激液=1640培养液+PMA（50ng/ml）+Iono（1ug/ml）+BFA（10ug/ml）。
4小时后收集细胞，加入PBS洗涤，弃上清。加入200ulPBS+5ul APC-CD4抗体。孵育20min。
离心，弃上清。200ul固定液固定20min。室温避光。
加破膜剂1ml，离心，弃上清。
加破膜剂200ul，室温避光10min后，加入PE-IL-17A抗体。室温避光，35min。
破膜剂洗涤，离心，弃上清，PBS200ul重悬。待测。 破膜剂是eBiosience公司的固定+破膜剂+BFA的kit。破膜剂是10×的，蒸馏水稀释的。
以上是我做实验的步骤。
请倪老师帮我看看有没有问题。附一张图，请倪老师和大家帮我看看是什么问题。谢谢！

niwanmao

从直方图看，似乎一点荧光都没有，你能不能再放一张cd4/il17的散点图。
你们实验室有没有其他人做这个实验？如果有，可以借点他们做的出结果的刺激液，验证一下。

jiaojiaoliu

实验室没人做这个,我去其它实验室可以借点.但是这个PMA和Iono已经是又新买的了,流式上机检测的老师只给了直方图,并且认为是破膜的问题. 如果加大破膜剂的浓度不知行不行?

niwanmao

实验室没人做这个,我去其它实验室可以借点.但是这个PMA和Iono已经是又新买的了,流式上机检测的老师只给了直 ...
jiaojiaoliu 发表于 2010-12-3 11:08

                               
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我是这样考虑的：
1、如果是破膜剂的问题，那么无论如何加大用量，都是没用的，看这个样子就感觉是一点都没有结合的。
2、需排除抗体原因，如果抗体本身就失效，那么无论你改变什么条件，都是没用的。
3、需排除刺激液问题，但刺激液一般都是无机试剂，失效的可能性微乎其微，我觉得基本上应该能排除。

所以，我觉得IL-17抗体、破膜剂这两个原因需排除，你完全可以让他们来验证，你说刺激液已经换过了，那么能不能让他们帮忙从哪里借一个test，而且又已经做出结果的IL-17或破膜剂，对比一下。

jingweis530

用CD69去验证一下刺激和破膜效果，排除抗体的问题，我认为很大可能是抗体的问题。

gdmcwjx2000

CD4+IL17+也只有0.2-0.4%，我觉得还是没有破膜的问题。可以这样试一下，按照上述步骤操作一次，同时另外在不用破膜的情况下，直接和CD4抗体一起标记上机测，对比一下两者的结果。

sugarswallow

我一般染IL-17时同时再染IFN-r，如果IFN-r出来了，而且一般正常人的IFN-R占CD4的20%以上，就可以挣证明活化体系是工作的，检测体系也是工作的。
还有，我觉得在步骤上：用破膜剂孵育的时间多长？破膜剂离心后，再用洗涤剂洗第一次？还有，我觉得每次加抗体之前只用100UL液体重选就行了，这样抗体还可以减半或者稍微减少一些？

qinyalu115

加破膜剂1ml，离心，弃上清。
你的破膜剂 是哪个厂家的啊  我建议你用beckman的 ，质量可靠  但是价格贵

livia_gu

请问各位前辈，我做的Foxp3的染色，破膜后还能用多聚甲醛固定第二天再上机么？因为动物细胞每次处理完了都很晚了，做流式的老师很不愿意晚上做，不知有什么解决的办法么？

niwanmao

livia_gu 发表于 2011-7-11 20:24

                               
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请问各位前辈，我做的Foxp3的染色，破膜后还能用多聚甲醛固定第二天再上机么？因为动物细胞每次处理完了都 ...

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