BODIPY 581/591 C11 (Lipid Peroxidation Sensor)

Atian

BODIPY 581/591 C11 (Lipid Peroxidation Sensor) 用来检测细胞的lipid peroxidation，bodipy探针会插入到细胞膜中，当细胞出现氧化反应，释放出来的ROS会使原本发红色荧光的探针淬灭为绿色（BODIPY® 581/591 undecanoic acid can be used to detect reactive oxygen species (ROS) in cells and membranes. Oxidation of the polyunsaturated butadienyl portion of the dye results in a shift of the fluorescence emission peak from ~590 nm to ~510 nm.），
我实验操作的步骤是先加药处理，清洗，再进行探针（bodipy-2uM）的装备，清洗，用PBS重悬细胞，然后上机检测，第一个图先设门，第二个图参考他人文献，有两种检测方法（两种横纵坐标）。

（1）选择点图，横坐标选择FITC-H（Green），纵坐标选择PE-H（Red），然后进行测量，
（2）选择histogram，横坐标选择FITC-A

只是按照这种方法操作，结果貌似看不出来差别（本人的细胞是GFP标记的细胞），所以看看是否有哥们姐们做这相关的实验，相互交流请教一下

七斗~

今天打了thermo的技术顾问，这个PE必须用561的激发光才能检测，一般的两激光的仪器都是488激发的PE，这个发射光会和FITC的发射光有补偿，而且不能调，所以要么就只检测FITC，要么就找带561激发光的仪器。

qihao309

你好，我最近也在做C11-BODIPY的染色，细胞染色后用荧光显微镜观察发现FITC通道的光会延迟激发，在镜下看到是逐渐亮起来的，这种情况下怎么用流式仪检测呢？

niwanmao

qihao309 发表于 2020-10-11 11:25
你好，我最近也在做C11-BODIPY的染色，细胞染色后用荧光显微镜观察发现FITC通道的光会延迟激发，在镜下看到 ...

是不是激发光效率的问题？

qihao309

niwanmao 发表于 2020-10-11 11:44
是不是激发光效率的问题？

老师，您说的激发光效率是什么意思？ 我用的是普通的荧光显微镜，细胞HK-2，染料是bodipy C11（10uM） 和 hoechst 33342 同时染得，，37°孵育30分钟，PBS洗3次

在镜下看DAPI 会有两种颜色，并且颜色随时间在变化，变化速度很快，


另外 在GFP通道看绿光 荧光也是逐渐变亮的，时间大概10s左右 我录了视频，详见附件里
但是在红色通道里看到的荧光是逐渐减弱的，减弱速度也比较快。
因为荧光变化太快所以也没法拍照定量了。

同时C11染料染同样的细胞做了一次流式，通道选择FITC 488/525  和 PE 561/585，
如图 红色峰bank组；蓝色峰是NC组，发现相对于blank组，染色组的PE荧光增加很明显，而FITC通道仅仅增强了一点点，并且我的处理组和对照组没有差异（阳性对照也没有差异），我考虑会不会因为FICT的激发时间很长，导致光还没有亮起来流式仪已经检测过了？ 如果是这种情况下该如何用流式检测这种染料呢？搜遍了文献也没有看到解决办法。

niwanmao

qihao309 发表于 2020-10-11 13:53
老师，您说的激发光效率是什么意思？ 我用的是普通的荧光显微镜，细胞HK-2，染料是bodipy C11（10uM） 和 ...

这个染料在流式的应用上应该不会有大问题，请见下面这篇《Optimization of the C11-BODIPY581/591 Dye for the Determination of Lipid Oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by Flow Cytometry》。
cyto.a.22338.pdf (576.42 KB, 下载次数: 85)

2020-10-11 21:02 上传

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之所以在荧光显微镜下出现这种转一个地方逐渐亮起的现象，我在想是否和荧光显微镜检测方式？例如需经过玻片，转移聚焦点时需要重新聚焦？

qihao309

niwanmao 发表于 2020-10-11 21:04
这个染料在流式的应用上应该不会有大问题，请见下面这篇《Optimization of the C11-BODIPY581/591 Dye fo ...

荧光显微镜看别的荧光，改变视野都 没有出现过这种问题，都是瞬间激发看到荧光的，只有这一个染料看到这种情况

niwanmao

qihao309 发表于 2020-10-11 21:10
荧光显微镜看别的荧光，改变视野都 没有出现过这种问题，都是瞬间激发看到荧光的，只有这一个染料看到这 ...

哦，荧光显微镜您比较专业，如果确实如此的话，还真得需要思考流式检测的步骤了。
那么是否观察过，这个荧光这次激发之后，等会儿再来看的话，是否瞬时发光呢？

qihao309

niwanmao 发表于 2020-10-12 09:08
哦，荧光显微镜您比较专业，如果确实如此的话，还真得需要思考流式检测的步骤了。
那么是否观察过，这个 ...

后来电话咨询了赛默飞的客服，他们认为荧光显微镜下观察到绿色荧光逐渐增强考虑是激光导致染料逐渐氧化的过程，我自己观察中也确实发现DAPI的光打完之后绿色更亮一些，考虑紫外的光的能量更强的原因吧。看来C11这个染料氧化这么快的话只能用流式检测了

yuanyuanyuanzhu

niwanmao 发表于 2020-10-11 21:04
这个染料在流式的应用上应该不会有大问题，请见下面这篇《Optimization of the C11-BODIPY581/591 Dye fo ...

您好，我也遇到了用BODIPY581/591染色，流式上机PE通道MFI增强特别明显的现象，不知道原因是什么。FITC通道药物处理组比空白对照组MFI只增强了一点几倍，但是PE却增强了10多倍