脾脏解离成单细胞培养以后细胞变小

immunology

把脾脏细胞用筛网磨碎以后，裂红，培养基重悬，细胞计数后用培养基稀释成相应浓度的细胞铺板，一组用药物刺激，另一组不刺激作对照，发现当培养24h以后，无论是实验组还是对照组，镜下观细胞均变小，FSC和SSC图上也是如此，是不是细胞都死亡了还是确实细胞离体培养后体积会变小，我实验组和对照组细胞都用CFSE标记了，浓度是5uM，然后用7aad染色发现细胞基本全是阳性。CFSE串光到7aad的percp通道也不能这么严重吧？是都死了还是7aad减CFSE的补偿确实很大？图1是新鲜刚离体脾脏细胞的FSC-SSC

图一，刚离体脾脏细胞的FSC-SSC

图二是培养了24h以后的脾脏细胞

图二，培养24h后的脾脏细胞

，FSC和SSC电压都一样。

niwanmao

只看到FSC/SSC的散点图，这其实未必是坏事，因为解离成单细胞时，可能对细胞有影响，导致FSC增大，随着培养状态的好转，细胞均一性变好了，变圆了，于是反映在FSC上，看上去就是变小了。
至于7-AAD的事情，是否可以考虑做个单染？

immunology

niwanmao 发表于 2019-5-17 22:35
只看到FSC/SSC的散点图，这其实未必是坏事，因为解离成单细胞时，可能对细胞有影响，导致FSC增大，随着培养 ...

倪老师，原文件有20M，传不上来，我只传上来一个我写的pdf版的说明，fsc文件我存在网盘上了，老师如果有空的话帮我看一下吧链接：https://pan.baidu.com/s/17ONY9KH5Ne9DvxbloPGUSQ      提取码：mg10
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTc3MTB8MmM5NTZjM2J8MTczNTk4NTQ0MXwwfA%3D%3D

niwanmao

immunology 发表于 2019-5-20 04:06
倪老师，原文件有20M，传不上来，我只传上来一个我写的pdf版的说明，fsc文件我存在网盘上了，老师如果有空 ...

选了两个数据看了下，发现CFSE和7-AAD之间的补偿是无法调节到位的，是否意味着这两个染料在你们这台仪器上无法搭配？

immunology

niwanmao 发表于 2019-5-20 15:25
选了两个数据看了下，发现CFSE和7-AAD之间的补偿是无法调节到位的，是否意味着这两个染料在你们这台仪器 ...

机器是BD FacsVerse，里面有7aad，percp-cy5.5以及percp的通道可选，并且选了一个以后，其他俩都不能选了，我觉得应该是可以的吧？CFSE不就是走FITC的通道吗？我也很纳闷为什么补偿调不过来，降低7aad的电压也不行。

niwanmao

immunology 发表于 2019-5-20 16:07
机器是BD FacsVerse，里面有7aad，percp-cy5.5以及percp的通道可选，并且选了一个以后，其他俩都不能选了 ...

你用的药物有没有荧光？

immunology

niwanmao 发表于 2019-5-21 08:32
你用的药物有没有荧光？

没有荧光，就是普通的药物。

niwanmao

immunology 发表于 2019-5-21 16:01
没有荧光，就是普通的药物。

具体是什么药物？药物性质可关注一下。