胞内染色的荧光素怎么选，有特别要求吗？

懒书虫

流式细胞检测做胞内染色，测Ki-67，用的是Invitrigen的固定破膜试剂，说明书中说“Add 100 μl of Reagent B (Permeabilization Medium) and the recommended volume of the FITC- and/or PE- conjugated intracellular antibody or the corresponding isotype control.”，请问一定要用这两种荧光素吗？买了APC anti-human Ki-67 Antibody，可不可以用？

Jeff

可以使用APC的荧光

niwanmao

说明书里面这是示例，说明书不知道你用在什么抗体染色上。
但是，你要确认你用的破膜剂可以破核膜。

懒书虫

niwanmao 发表于 2019-6-18 14:14
说明书里面这是示例，说明书不知道你用在什么抗体染色上。
但是，你要确认你用的破膜剂可以破核膜。 ...

不是有核孔吗？破完胞膜，抗体通过核孔可以进入吗？

说明书上是这样的：CLINICAL RESEARCH APPLICATIONS:
Flow cytometric analysis with monoclonal antibodies has historically been
restricted primarily to cell surface molecules. For this reason, intracellular antigens
such as cytoplasmic or nuclear enzymes, oncoproteins, cytokines,
immunoglobulins, etc., were largely excluded from such analysis. Also excluded
have been cytometric studies designed to address the cytoplasmic localization of
some well established membrane-associated molecules such as CD3 and CD22.

懒书虫

Jeff 发表于 2019-6-17 20:03
可以使用APC的荧光

谢谢

niwanmao

懒书虫 发表于 2019-6-19 12:12
不是有核孔吗？破完胞膜，抗体通过核孔可以进入吗？

说明书上是这样的：CLINICAL RESEARCH APPLICATIONS ...

不破核膜是进不去的，兄弟。我不知道你这段文字哪来的，他的主要目的还是为了说明胞内染色大大扩展了流式应用，并不是说核内标记不需要破核膜。

Jeff

懒书虫 发表于 2019-6-19 12:57
谢谢

流式中跟你用的什么荧光没有什么关系（只是某些荧光素可能会受破核剂的影响，导致荧光减弱）。遵循流式配色的基本原理就可以了~~~~~说明书上只是示例用荧光并不是说只能用这个荧光。记得使用专门的破核剂就好了

灬MIKI灬Love

你可以考虑，Thermofisher 的破核膜Kit（原来的ebioscience品牌）；或者干脆不用Ki67发检测增殖，用CFSE方法检测增殖，这个比较公认

菁菁

近期在做单核细胞的胞内染色。有几个问题很疑惑，想向各位老师求教：
1、细胞激活。在丁香园上曾见到过建议另加做一个单染CD69的，看看是否刺激成功，据说90%以上被认为是刺激成功，不知是否需要？
2、另外，关于设定对照。胞内染色需要设多少对照呢，有建议设刺激对照的（刺激 VS 不刺激），也有建议设同型对照的、还有建议设FMO对照的。所以，这个胞内染色，应该如何设对照？已然凌乱....
3、有建议在刺激阻断后，细胞培养的上清液可以收集起来做ELISA，但是细胞因子不都被阻断了么，释放入上清的应该很少了吧，这样做是否有意义呢

niwanmao

菁菁 发表于 2019-7-14 01:01
近期在做单核细胞的胞内染色。有几个问题很疑惑，想向各位老师求教：
1、细胞激活。在丁香园上曾见到过建议 ...

1、CD69是看淋巴细胞活化，你做道单核细胞，为啥也用这个？
2、对照用Fc Blocking之后的FMO对照。
3、你这些建议我发现都是乱七八糟的，我还是没弄清楚你的需求究竟是什么，如果要测细胞因子，刺激完，取上清做流式CBA就能同时测多个细胞因子，比ELISA又准又快、通量又高。