请教关于AV-FITC和PI双染法检测细胞凋亡

zhaozhuozhao · 发表于 2010-12-20 21:38:54

各位老师好，我最近用北京宝赛公司的凋亡试剂盒检测药物给药后细胞凋亡情况，附件中有四个图，第一张图CK表示空白未加药组，未用染料处理；第二张图CK也是空白未加药组，用染料双染；第三张图Y800+AV表示给药组单染，以调节FITC通道的荧光补偿；第四张图Y800+PI表示给药组单染，以调节PI通道的荧光补偿；第五张图Y800+AV+pI表示给药组双染。我的问题是：1.为何我的四组图中除了Y800+PI组Q1象限内有细胞其他组基本均为0？2.为何第三张图单染组内AV对应的Q4比双染的第五张图的Q2要高呢？样品可都是同样药物同样的处理，只是染色方法不同而已，同样的问题也存在于第四张图单染组内PI对应的Q1比双染的第五张图的Q1要高.3.我记得当时的Y800+AV上样后呈火箭状，好多细胞都漏到Q2区域，流式老师将PE的值调到50几才勉强将大部分细胞置于Q4区域，我想问一下这正常吗？谢谢各位老师指教！

细胞凋亡.pdf (405.42 KB, 下载次数: 120)
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=ODJ8MTQxNmU1MDN8MTczMzMzODUxNnwwfA%3D%3D

stef1981 · 发表于 2010-12-21 08:42:55

回复 zhaozhuozhao 的帖子
1、Q1象限按理说应该是死亡细胞，但是基本上所有死亡细胞都能被
AnnexinV-FITC染上，所以加上AnnexinV-FITC以后会出现在Q2象限，跟晚期凋亡细胞混合。
2、三、四、五组是同样的细胞同样药物同样的处理吗？如果是，差别应该没那么大。如果是不同的细胞瓶培养的，会有一些操作上带来的误差。
3、正常，都需要补偿

兔子赵 · 发表于 2010-12-21 11:07:55

1、个人认为Q1是细胞膜结构几乎不存在的坏死细胞。即使细胞形态很差或者基本坏死，Q1都很少。具体为什么，我也不知道。1楼老师说的在Q2象限应该是原因，但我觉得如此算来，样本差的时候Q2比率很高才对，但是没有。我也求解释啊。
先回答3：你说的PE值是指补偿调到了50%几的话，我觉得高的太不可信了。
2：如果我理解的3对了，那么应该重调补偿再看结果。

niwanmao · 发表于 2010-12-21 13:10:03

楼主下次发帖时，可以考虑换行，这样我看着好累。
上面几位FLOWER都讲了一些，我总体看了，感觉楼主对AV-PI的原理、单染双染怎么对应等似乎还没理解。其实问题很简单：
1、Y800+PI组的Q1象限就是PI+的细胞，这部分细胞的比例＝第5张图的Q1+Q2。别的组比如AV单染组，你PI都没加，Q1当然没细胞喽。
2、第3张AV单染的Q4＝第5张的Q2+Q3，你算算看，是不是差不多？
3、你所谓的PE值我估计肯定指补偿，补偿到50几问题也不是很大，只要能调好，但最好调小一点（可以通过把AV的电压再调高一点，PI的电压调低一点，就能实现30％左右的补偿值）。

zhaozhuozhao · 发表于 2010-12-21 21:02:48

首先先谢谢各位老师的热情指导。
回答stef19881老师的问题，三、四、五组是同样的细胞同样药物同样的处理，而且是在同样的六孔板中生长的，三、四组与五组唯一不同的是三、四组是一孔加药细胞，分为两管，即为两个单染组，五组是一孔单独为一管，即为双染组。我自己在想这样的差异结果是否与染料的饱和度有关，您说呢？
倪老师，我刚开始看完您的建议，我觉得有道理，但我算了一下Y800+PI组的Q1象限的细胞的比例与第5张图的Q1+Q2勉强差不多，但第3张AV单染的Q4与第5张的Q2+Q4就相差很大啦！

niwanmao · 发表于 2010-12-21 22:45:09

首先先谢谢各位老师的热情指导。
回答stef19881老师的问题，三、四、五组是同样的细胞同样药物同样的处理， ...
zhaozhuozhao 发表于 2010-12-21 21:02

登录/注册后可看大图

是不是第5张的Q2+Q4>第3张的Q4？相差大可能跟你的标本存在碎片或检测时的一些非特异性信号有关。如果第3和第5的标本是一样的，单染AV的Q4＝双染的Q2+Q4的道理是没错的。

stef1981 · 发表于 2010-12-22 08:48:57

回复 zhaozhuozhao 的帖子
六孔板中不同的孔之间都会有些差异，这种情况只能多做重复。
有可能是细胞生长过了，死细胞比较多，造成的误差也比较大。一般在细胞在孔板上长到80%收集为宜

zhaozhuozhao · 发表于 2010-12-22 19:59:06

我还想问一下倪老师，我的荧光补偿是否未调好啊？我担心这样的图发文章是否能用？谢谢您的指导

niwanmao · 发表于 2010-12-22 21:44:35

我还想问一下倪老师，我的荧光补偿是否未调好啊？我担心这样的图发文章是否能用？谢谢您的指导

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zhaozhuozhao 发表于 2010-12-22 19:59

登录/注册后可看大图

荧光补偿还可以啊。虽然补偿值太大了点，但是问题不大。
只要结果理想，就可以发表。当然，PI单阳性的Q1细胞不能太多，否则，这结果就不可靠了。

zhaozhuozhao · 发表于 2010-12-23 09:54:19

好的，谢谢您的指导，和您交流我学到了很多知识！谢谢

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