用Miltenyi的anti－PE MicroBeads对新鲜分离的PBMCs进行CD8+细胞的...

stf1990

如题，组里刚买了anti－PE的Microbeads，周一试了一下用它来分选PBMCs（10∧7）里CD8+细胞，分选完之后没有培养直接上机，但是分选出来的细胞纯度较低，只有70%。 且如图分选出的CD8+细胞呈现鱼尾型，这是因为CD8连续表达的缘故，所所以beads将CD8+low跟CD8+high都筛选出来的缘故吗？求助各位老师解答疑惑，不知有没有什么提高纯度的方法？感谢！！！（PS：column用的是MS，为提高纯度用了两个column，将第一遍筛选的细胞再过了一遍column）

niwanmao

stf1990 发表于 2019-7-3 18:10
这是没有分选前PBMC中CD8+细胞比例

验证的时候CD45或者淋巴细胞特异性标记都不加？这样你的纯度评估就大打折扣了，因为混入太多碎片和非特异信号。
CD8高表达的，是细胞毒T。
还有CD8弱表达的，是NK细胞。

stf1990

这是没有分选前PBMC中CD8+细胞比例

stf1990

谢谢倪老师，因为说明里直接用SSCA和CD19-PE就验纯度了，我就直接用SSCA 和CD8-PE来验了，那我试试把CD45加上再验证一下纯度。

stf1990

niwanmao 发表于 2019-7-4 14:28
验证的时候CD45或者淋巴细胞特异性标记都不加？这样你的纯度评估就大打折扣了，因为混入太多碎片和非特异 ...

倪老师，如果为了排除碎片和混杂信号，那分选细胞以后培养一段时间，用30um的filter滤过，离心，再加cd45染色，可行吗？

niwanmao

stf1990 发表于 2019-7-4 16:50
倪老师，如果为了排除碎片和混杂信号，那分选细胞以后培养一段时间，用30um的filter滤过，离心，再加cd45 ...

只要染了CD45，过滤是没有必要的。

stf1990

niwanmao 发表于 2019-7-5 11:28
只要染了CD45，过滤是没有必要的。

谢谢倪老师，确实管用。加了CD45以后，碎片信号大部分消失，纯度提高了不少。把图附上供大家参考,B是筛选过后阴性细胞，C是阳选的细胞。

niwanmao

stf1990 发表于 2019-7-5 17:29
谢谢倪老师，确实管用。加了CD45以后，碎片信号大部分消失，纯度提高了不少。把图附上供大家参考,B是筛选 ...

恭喜恭喜