染双色细胞流式

yangjf

各位老师好，我准备做双色细胞流式，不过并不是染的颜色，而是细胞内吞的颗粒，未被细胞酶解的时候呈弱红光，被细胞酶解之后呈明亮的绿色，我的问题是我的对照是不是要做阴性管一个，还有两个单染管，但是细胞发的荧光不是染料染的，这个怎么确定用什么做单染管啊

niwanmao

如果一个细胞，只能处于未酶解、酶解这两种状态之一，就不需要单染管，直接染好，应该存在绿光单阳性和红光单阳性群。

yangjf

niwanmao 发表于 2019-7-4 14:30
如果一个细胞，只能处于未酶解、酶解这两种状态之一，就不需要单染管，直接染好，应该存在绿光单阳性和红光 ...

明白了老师，那还想问一下，散点图中如果存在这两团细胞群，那怎么区分哪团是红色，哪团是绿色呀，用的是CytoFlex

niwanmao

yangjf 发表于 2019-7-4 16:45
明白了老师，那还想问一下，散点图中如果存在这两团细胞群，那怎么区分哪团是红色，哪团是绿色呀，用的是 ...

因为不清楚你所说的东西是什么，需要先了解波长，然后从仪器的滤光片上找对应的滤光片通道

yangjf

niwanmao 发表于 2019-7-5 11:29
因为不清楚你所说的东西是什么，需要先了解波长，然后从仪器的滤光片上找对应的滤光片通道 ...

我用的通道是FITC和Percp-Cy5.5，主要是操作上不懂，就是我要跑流式的细胞样品，有的是细胞是FITC通道的，有的是Percp-Cy5.5通道的，我想得到这两种细胞的比例应该如何操作呢？

暴打科研小怪兽

假如内吞颗粒用APC偶联，需要设置对照组
对照组：APC偶联的颗粒物质与目标细胞在4度作用相同时间（吞噬细胞在4度无吞噬功能）
实验组：APC偶联颗粒与细胞在合适温度

流式细胞术
1. FSC和SSC圈出目的细胞
2. APC和SSC双散点图。对照在APC与SSC散点图里红光稍高，实验稍低。

个人觉得应该通过荧光素偶联颗粒。不知颗粒是否自带荧光。

yangjf

暴打科研小怪兽 发表于 2019-7-5 15:09
假如内吞颗粒用APC偶联，需要设置对照组
对照组：APC偶联的颗粒物质与目标细胞在4度作用相同时间（吞噬细胞 ...

颗粒是自带荧光的，先前做过confocal,所以选的FITC和PC5.5。想问一下双散点图的横纵坐标都对应的是什么呢

niwanmao

yangjf 发表于 2019-7-5 14:11
我用的通道是FITC和Percp-Cy5.5，主要是操作上不懂，就是我要跑流式的细胞样品，有的是细胞是FITC通道的 ...

做一个散点图，横坐标FITC，纵坐标PerCP-Cy5.5，圈两群单阳性细胞即可。

yangjf

niwanmao 发表于 2019-7-6 09:51
做一个散点图，横坐标FITC，纵坐标PerCP-Cy5.5，圈两群单阳性细胞即可。

     老师，我的实验背景是这样的，我做的主要是带荧光标记的颗粒与细胞孵育，流式测带荧光的细胞阳性率。
     我的实验步骤是在control组设置阴性对照，在SSC-FSC图上圈出非碎片的细胞，将细胞群做直方图，圈出小于1%的阳性范围，然后跑阳性样品组，从直方图上观察单色荧光阳性率。
      我现在是要做带两种荧光标记的颗粒与细胞的孵育，那跑流式的时候，会出现三种细胞，没有内吞任何颗粒的；内吞后呈一种荧光颜色的；内吞后呈另一种荧光颜色的；那么我可不可以用这样的方法：
      跑control组时，在图上圈出非碎片细胞后，做两个直方图，一个以FITC为横坐标，一个以PC5.5为横坐标，再分别在两个直方图上圈出阳性范围。然后再跑阳性样品组，在直方图上观察两种荧光细胞的比例。
老师你看这个方案合理吗？