这样的图形，你会如何分析？

niwanmao · 发表于 2019-7-10 20:12:36

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下面这个图形，估计大多数人都会有同样的疑问，我已经将Fc受体阻断了，做的又是单色，邻近应该没有干扰，此时的未染色对照就等于多色里面的FMO了，这样设置门正确吗？

设门原则是没错，但错在另一个关键点：抗体已经经过正确滴定。只有正确滴定过的抗体用量，才能采用这个设门位置。
但这个图中，我们明显看到阴性峰的非特异性荧光增强，为什么？因为CD3在淋巴细胞里面非阴即阳，所以可以确定

因此，正确的设门位置应该如下图：

CD3这种分群明显的标记好做，即使抗体未滴定好，门的位置也可以通过阴性峰、阳性峰的分界确定，但如果碰上下面这种分群不清的呢？

同样进行Fc阻断之后，用未染色（单色实验时）或FMO（多色实验时）设门，见下面三幅图：

同样，如前面所述，要用这个门来分析CCR7的表达，也是需要事先进行抗体滴定。

抗体的非特异性染色主要原因有两种：

抗体与膜表面蛋白的非特异性结合
由抗体浓度过高引起
抗体滴定的目的就是为了找到最佳的浓度，在该浓度之下，阴性峰不会出现明显的非特异性染色，基本保持在未染色位置，同时，阳性峰能获得最强的荧光强度。

至于抗体滴定具体操作，请参考论坛上我们发过的两篇参考价值比较高的帖子：

stf1990 · 发表于 2019-7-11 16:28:42

本帖最后由 stf1990 于 2019-7-11 16:31 编辑

学习了, 也就是说FcR 阻断剂是防止抗体与膜蛋白的非特异性结合，但在抗体过高浓度仍有可能导致阴性细胞群的非特异性染色？

stf1990 · 发表于 2019-7-11 16:37:01

倪老师，FcR是否在B细胞表达较多，T细胞表达较少,因我们组在对T细胞进行染色时，无论有没有FcR blocking进行阻断，染色结果基本无差别。

btx362237729 · 发表于 2019-7-12 11:49:38

所以找B淋巴细胞来做内对照比较好

niwanmao · 发表于 2019-7-13 16:35:11

stf1990 发表于 2019-7-11 16:37
倪老师，FcR是否在B细胞表达较多，T细胞表达较少,因我们组在对T细胞进行染色时，无论有没有FcR blocking进 ...

相对来说，淋巴细胞整体背景就偏低些。B细胞应该没有那么高啊，是不是恰好是某个抗体问题？
Fc受体在各类细胞上的表达参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6255-1-1.html

leosurely · 发表于 2019-7-19 10:13:43

抗体滴定是个很重要的过程，除此之外在制备样本过程中，洗涤的次数也与阳性峰的位置有关。

112358answer · 发表于 2020-4-30 15:04:05

做细胞系的话需要加Fc阻断吗？毕竟培养时候就有FBS

niwanmao · 发表于 2020-5-1 15:12:05

112358answer 发表于 2020-4-30 15:04
做细胞系的话需要加Fc阻断吗？毕竟培养时候就有FBS

需要。

immunology1988 · 发表于 2020-5-7 16:02:34

112358answer 发表于 2020-4-30 15:04
做细胞系的话需要加Fc阻断吗？毕竟培养时候就有FBS

FBS对细胞系阻断有啥关系吗？

112358answer · 发表于 2020-5-7 17:38:41

immunology1988 发表于 2020-5-7 16:02
FBS对细胞系阻断有啥关系吗？

我们一般不用Fc抗体阻断的话，就用FBS或者BSA封闭一下

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