小鼠外周血淋巴细胞FSC-A SSC-A分群

kriswu

倪老师，我是最近才开始做小鼠外周血淋巴细胞的划分鉴定，图中是我一开始在FSC-A SSC-A的分群，您看一下样品这样的分群正常吗？ 我自己圈画的这一群细胞是否能代表所有的CD45+白细胞？因为是多色共染，目前手上没有合适的CD45+抗体，就没去做这个染色；细胞死活的染色后面可以尝试一下DAPI。图中有两个主群都有CD3e-FITC阳性细胞，我圈到的那一群CD3e细胞主群中也是CD19 B细胞的主群，我想问一下另外一个主群是否也是正常的细胞呢？

niwanmao

建议在排除死细胞、排除粘连体之后，再看看FSC/SSC的分布，如果仍是如此，需考虑样本质量问题或处理上的原因了。

qingshi

niwanmao 发表于 2019-8-6 22:49
建议在排除死细胞、排除粘连体之后，再看看FSC/SSC的分布，如果仍是如此，需考虑样本质量问题或处理上的原 ...

我认为他圈的是对的，但是不够典型。发一个我的图，红的群体包涵有人源化的免疫细胞。

kriswu

    非常感谢倪老师以及qingshi的回答，最近重新做了几次，并同时做了去粘连信号和染死活以及CD45，圈门问题已经解决。但是鄙人现在还有一处困惑：
    我有的时候单核细胞以及粒细胞的主群会占比例很多，有的时候淋巴细胞群占比例很多，我的实验操作是，小鼠取血500ul左右于医用抗凝管，加入红细胞裂解液3~4 mL室温裂解10min，然后150-200g 4度离心5min，再次加入2mL裂解液重悬，室温静置裂解5分钟，再次离心后用含5% FBS的PBS重悬4度封闭，然后一抗孵育。
请问这样做是否会对细胞有影响？哪里操作容易造成细胞比例失调？