磁珠分选小鼠脾脏CD8+细胞纯度上不去

夏洛克

用美天旎anti-APC 磁珠和MS小柱子分选小鼠脾脏细胞，步骤和结果如附图，抗体和磁珠有试过完全按照说明书推荐的等比例添加，结果与下图实验结果基本一致，分选纯度也只有50~60%。 过一遍柱子纯度只有50%~60%，过两遍柱子才能到80%   但是这个纯度还是不够啊，分选之后培养至少要90%的纯度，跪求大神指点，按道理脾脏细胞很干净不需要过两次柱子。

liuruiluna

正选一般要过3次柱子吧

夏洛克

liuruiluna 发表于 2019-10-1 09:47
正选一般要过3次柱子吧

您好，您是说阳选细胞您一般过三次柱子？  会影响细胞活性继而影响后续培养吗？

liuruiluna

影响培养的因素很多，多过一遍柱子不至于影响多少，但是科学意义上说，当然分选时间越短，对活性保护越好，磁珠分选是这样的，纳米级磁珠很小，多过一遍纯度会提高，相应的回收率会降低，纯度与回收率两者就是这样的一个关系。你要看你的需求，如果纯度达不到你的需求，那就通过多过一遍柱子提高纯度，牺牲一些回收率和一点点细胞活性，看什么对你最重要。 有时候流式分选为了达到最大纯度还做二次分选嘞，那个对活性的影响更大。看自己实验的主要矛盾和次要矛盾。 另外，你那个流式图，不应该把debris圈进去，那些不是细胞，记录在纯度分析里没有意义。主要看分出来的细胞的纯度。你重新圈一下，可能纯度已经达到90%以上了

hezeljgouc

看你的废液里CD8 T细胞几乎没有，说明磁珠标记CD8 T细胞的效率还是比较好的，只不过在过柱时有大量的CD8- 细胞滞留在柱上了，没有冲下来。就我个人的经验，在磁珠标记细胞结束，上柱分选前用40 μm的细胞滤器过滤细胞，减少各种原因导致的细胞粘连，避免其堵塞分选柱，导致大量的未被磁珠标记的细胞被堵在了柱上，降低分选的纯度。另外，我不太认同你“用500 μl buffer润洗分选柱，待液面流完时立即加样品”的做法，你可以尝试在柱上留至少一半体积的buffer，然后把细胞加到buffer中，降低进入分选柱的细胞悬液的浓度，防止短时间内过多细胞进入柱体，导致分选柱堵塞；你也可以把细胞悬液进行一定比例的稀释后分多次上柱。