如果做FACS出现系统误差，是不是很可怕？

cellprobe

最近在研究干细胞的免疫调控实验，对照组是免疫细胞，实验组是免疫细胞+干细胞。
不管是检测T细胞还是巨噬细胞的指标，不管是细胞内的还是细胞外的，只要是和干细胞共培养的，所检测基因的表达水平都是明显的降低。
理论上应该有升高也有降低的，但是不明白：做了很多次实验了，近十个marker，他们的表达水平都是明显降低的。
我首先怀疑的是自己流式操作有问题，然后是实验设计有问题。
不知道这个系统误差出在哪里？

cellprobe

是不是用抗体染免疫细胞和干细胞的混合物的时候，干细胞消耗了一部分抗体，造成了免疫细胞的抗原染色强度偏低，所以看到所有免疫细胞标志物在和干细胞共同培养以后都降低？

cellprobe

这两幅图里面，被圈定在门里面的都是免疫细胞，可以看到从流式染色结果来看，免疫细胞和干细胞一起染色的时候，免疫细胞的染色强度偏低。

niwanmao

cellprobe 发表于 2019-10-18 14:36
这两幅图里面，被圈定在门里面的都是免疫细胞，可以看到从流式染色结果来看，免疫细胞和干细胞一起染色的时 ...

你这两个图里面是什么标记？怎么都挤在右上？

cellprobe

niwanmao 发表于 2019-10-19 09:39
你这两个图里面是什么标记？怎么都挤在右上？

是PE+APC，可能电压大了，没有调好。

niwanmao

cellprobe 发表于 2019-10-20 20:19
是PE+APC，可能电压大了，没有调好。

PE和APC是荧光素，我是说你做的是什么抗体？

cellprobe

niwanmao 发表于 2019-10-20 20:52
PE和APC是荧光素，我是说你做的是什么抗体？

APC是CD14， PE是CD206/TNF-a/IL-6/IL-10。PE是四种标志物，都是降低的趋势。

cellprobe

niwanmao 发表于 2019-10-20 20:52
PE和APC是荧光素，我是说你做的是什么抗体？

每个样本分成四份，有四个染色方案：APC是CD14， PE的抗体有四种：CD206/TNF-a/IL-6/IL-10，都是降低的趋势。

niwanmao

cellprobe 发表于 2019-10-20 23:04
每个样本分成四份，有四个染色方案：APC是CD14， PE的抗体有四种：CD206/TNF-a/IL-6/IL-10，都是降低的趋 ...

如果有可能，把完整的设门图放上来，如果上面已经是完整的细胞信号，那么就得考虑电压是不是过高了。

cellprobe

niwanmao 发表于 2019-10-22 09:00
如果有可能，把完整的设门图放上来，如果上面已经是完整的细胞信号，那么就得考虑电压是不是过高了。 ...

上面两张图是去除细胞碎片得到的数据，应该是电压过高。可是我的问题是所有的免疫细胞在所有的实验中，只要和干细胞共同培养，所有的检测抗原的表达水平都降低，我曾经怀疑是抗体浓度低了的问题，但是我把抗体的浓度加大几倍以后，还是出现这样的趋势。