如何实现流式数据的标准化？

Janexuan

1.检测HBV患者外周血PBMC中Treg的比例（按照CD4+CD25+CD127-标记Treg,用CD25 iso、CD127 iso,圈定Treg的阳性门，将同型对照的阳性门内细胞控制在0.5%以内，用所得的样本管中阳性细胞的比例减去同型对照门内阳性细胞比例，即为Treg的比例）？设置单阳管，使用Flowjo X调节荧光补偿，正确无误，但Treg细胞群总是往下偏，类似于补偿调过的形态，不知道是什么原因?
2.老师让检测患者外周血各T细胞表型中PD-1的表达量。（即各Tn、Tcm、Tem、Te中PD-1的表达量），panel如下：1.空白管 2.CD3/4/8/CD45RA iso/CCR7 iso 3.CD3/4/8/CD45RA/CCR7/PD-1 iso 5.CD3/4/8/CD45RA/CCR7/PD-1 。按照两周不同的圈门方式，1）先圈PD-1+ CD4+T细胞，再圈这部分细胞的各T细胞表型，按照阴性控制组细胞在2%以内，2）先圈T细胞表型，再圈各亚型T细胞中PD-1+ 的表达量。（按理说，Tn应该不会有PD-1的表达，但PD-1+ CD8 Tn 为19.92%？  原因：猜测是CD8 T细胞比例太少导致？）   两种圈门方式圈出来的数据差异大。不知道应该以哪种圈门方式为主？
3.数据标准化问题，我每次流式上机检测样本， 多色都会使用单阳管调节补偿，通过控制同型对照组阳性细胞群控制在2%以内，圈定样本细胞群的阳性群（严谨应该使用FMO对照，暂忽略这个问题。）例如抑制性分子的表达量。通过相减的方式，得到我的数据。不知道这种判定阳性的方式，是否正确。能否适用于每次流式检测，这样每次得到的数据，是否具有可比性？
欢老师各抒己见，非常感谢老师的热心解答！

niwanmao

染的挺好的啊。你说的事情，可能还是由于背景过高，导致iso比例偏高的问题。
这种情况，你可以试试加死活染料，排除死细胞，并且事先进行Fc Blocking，这两个措施都上去，相信就没问题了。

Janexuan

样本用系新鲜分离的PBMC，台盼蓝染色，镜下几乎未见死细胞，故未加死活染料。所有样本，都加用了Fc Blocking,且流式染色缓冲液中都加了少许FBS。可能还是由于清洗的不干净导致背景染色过高所致吧。倪老师，这个，每次流式实验，通过控制iso在2%以内，用以判定阳性细胞群，这种判定方式是否正确呢？是否适用于比较不同批次的流式结果呢？

Janexuan

niwanmao 发表于 2019-10-19 15:22
染的挺好的啊。你说的事情，可能还是由于背景过高，导致iso比例偏高的问题。
这种情况，你可以试试加死活染 ...

样本用系新鲜分离的PBMC，台盼蓝染色，镜下几乎未见死细胞，故未加死活染料。所有样本，都加用了Fc Blocking,且流式染色缓冲液中都加了少许FBS。可能还是由于清洗的不干净导致背景染色过高所致吧。倪老师，这个，每次流式实验，通过控制iso在2%以内，用以判定阳性细胞群，这种判定方式是否正确呢？是否适用于比较不同批次的流式结果呢？

niwanmao

Janexuan 发表于 2019-10-20 14:21
样本用系新鲜分离的PBMC，台盼蓝染色，镜下几乎未见死细胞，故未加死活染料。所有样本，都加用了Fc Block ...

台盼蓝是以前的一个方法，但在流式上面，不完全等同。
建议试一下，效果会好。
阴性对照的百分比一般没有绝对的规定，但一般在2％以内比较常见。

Janexuan

niwanmao 发表于 2019-10-20 20:57
台盼蓝是以前的一个方法，但在流式上面，不完全等同。
建议试一下，效果会好。
阴性对照的百分比一般没有 ...

好的  谢谢倪老师！