8色试验关于FMO的问题

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现在再做一个8色的实验,样本外周血,检测的是外周血淋巴细胞的里面cd4,cd8细胞亚群表面一些趋化因子以及表达IFN-γ,IL-4的能力.现在已经做了几次预实验,对于选用对照的问题还是想和大家请教一下.
主要问题如下
1. 对于有一些分群不明显的marker是否直接使用FMO来画门?
2. 在多色中,同型对照是否已经没有意义?我还需要专门去买同型对照的抗体吗?
3. 有4个通道均分群不明显,那意思是要做四个FMO? 这样子对抗体消耗量很大,能都前几次做完大概确定好了门就不再继续做FMO了?
4. 倪老师以前说过未刺激的生物学对照可能相对于FMO和同型对照更加有对比性, 我这个实验也是需要使用PMA刺激的,那是否意思生物学对照可以取代FMO对照了呢?阴性对照直接使用未刺激的染了8色的样本作为对照?

另外,还有一个基础知识的问题, 看了很多帖子, 明白了FC阻断剂的原理及其地位,但是对于同型对照,还是存在一些疑虑.
1同型对照到底是如何发挥效应的呢? 结合FC还是FAB呢, (http://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=4452&highlight=%E5%90%8C%E5%9E%8B%E5%AF%B9%E7%85%A7)这一篇说细胞表面抗体的Fab段可能会与细胞表面发生低亲和力、非特异性结合，意思就是 同型对照结合的是FAB. FC阻断剂结合的是FC受体,这属于两种不同消除背景荧光的方式?

niwanmao

用FMO对照设门，不用同型对照，但需做好Fc Blocking。
做几个FMO，与你要设门分析的指标有关，一批同种属样本做一个即可。
未刺激的生物学参照，只要在细胞特性上没改变太多（例如有些诱导分化的，细胞性质发生了改变），就可以用。
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2627443

niwanmao 发表于 2019-10-25 07:50
用FMO对照设门，不用同型对照，但需做好Fc Blocking。
做几个FMO，与你要设门分析的指标有关，一批同种属样 ...

非常感谢倪老师的回答，下次一定注意发帖的规则。
回到老师的解答上。如果我有3个分析指标，而且分群不明显，那么这个时候意思是我需要配置3管FMO分别来画门。 但是我这一批实验都是人的外周血，所以我不需要每一次都做FMO，不知道我理解的是否正确？
另外，前期预实验中发现有一种现象，刺激之后，相对阴性管（就是刺激后+fc block），试验管的主群明显向右偏移，补偿应该是没问题的（可见下图），这种情况按照阴性来画门是否合理呢？还是说即使调好了补偿还是不能排除其他通道对这个pe通道的影响？数据见下图。还恳请倪老师解答，万分感谢!

Spillover into PE channel

niwanmao

2627443 发表于 2019-10-27 13:47
非常感谢倪老师的回答，下次一定注意发帖的规则。
回到老师的解答上。如果我有3个分析指标，而且分群不明 ...

FMO的理解是对的。

这两个图里面，阴性虽然是刺激后细胞＋Fc Block，但是是否FMO？就是说其它几个通道的抗体是否加了？

2627443

niwanmao 发表于 2019-10-27 19:43
FMO的理解是对的。

这两个图里面，阴性虽然是刺激后细胞＋Fc Block，但是是否FMO？就是说其它几个通道的 ...

这个阴性是刺激之后加了fcblock，但是没有加任何抗体的，类似blank管。
有时候会在想，补偿调好了，那不是应该可以基本排除其他通道对你要检测通道的指标的影像，这种情况下还需要做FMO吗。

niwanmao

2627443 发表于 2019-10-31 14:16
这个阴性是刺激之后加了fcblock，但是没有加任何抗体的，类似blank管。
有时候会在想，补偿调好了，那不 ...

设门需要用FMO，而不是blank