关于人外周血PBMC分离过程中可疑RBC污染疑问？

suger529

我使用的是索莱宝人淋巴细胞分离液（Ficoll-hypague密度梯度离心）对新鲜外周全血分离PBMC，离心后细胞分层非常明显，吸取了中间白膜层细胞到15ml离心管后再加入15mlPBS离心洗涤后，离心管底部PBMC总是可见非常少量的红晕。请问这是红细胞污染吗？已经非常严格的按照说明书的操作，为什么每次都会出现这种现象？我需要PBMC进行胞外荧光抗体染色前需要裂解红细胞吗？

qiulinluo

我们之前有出现过少量红晕对实验没什么影响。    你们离心转速？我们1800g 25min 升速1 降速1    吸的时候小心一点，基本就不会有红晕

suger529

qiulinluo 发表于 2019-11-7 08:44
我们之前有出现过少量红晕对实验没什么影响。    你们离心转速？我们1800g 25min 升速1 降速1    吸的时候 ...

我们的转速是800g，20min。说明书水平转子500-1000g，最大不能超过1200g。

qiulinluo

suger529 发表于 2019-11-7 08:49
我们的转速是800g，20min。说明书水平转子500-1000g，最大不能超过1200g。

是仪器型号不同吗？我们这边分PBMC都是1500g或1800g

vitaminyyc

来自sigma的标准PBMC分离protocol中有提到这个问题，你看看有没有用：
红细胞和淋巴细胞污染增加       
A. 温度过低。        所有Ficoll-Paque产品的密度在低温下都会变高（参见注释：密度和温度），导致红细胞聚集不佳，从而影响粒细胞和红细胞进入Ficoll-Paque培养基层。将温度升至18ºC至20°C。
B. 离心速度过低或离心时间过短        必须使用足够的时间和离心力来确保非淋巴细胞的完全沉降。

参考网站：https://www.sigmaaldrich.com/chi ... tandard-method.html